Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

נוקלאז אצבע האבץ או ZFN מכיל תחום מאקרו מיוצב יון אבץ, קושר DNA המחובר לתחום אנדונוקלאז באמצעות מקשר. מבנה זה מסייע בשמירה על ספציפיות בעת חיתוך DNA.

כדי להשתמש ב-ZFNs לעריכת גנום, קחו תרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. השלם אותו עם פלסמיד המקודד ZFN. הוסף פלסמיד תיקון המכיל את גן המטרה ואת גן העמידות לאנטיביוטיקה הדחוס בין זרועות הומולוגיה או HAs. אלקטרופוראט את תערובת התא-DNA שבה הזרם החשמלי מקל על כניסת פלסמידים לתוך התא.

ברגע שנכנסים פנימה, מוטיבים של אצבעות האבץ של ZFN המתורגם נקשרים לשלישיות של זוגות בסיסים משלימים בגנום המארח, וממקמים נכון את אנדונוקלאז הגבלת Fok-1 באתר המטרה. ZFNs נקשרים לגדילים מנוגדים בזוגות ומאפשרים להומודימריזציה של Fok-1 ליצור מרכז קטליטי פעיל שבו Fok-1 מייצר שבירות דו-גדיליות של DNA או DSBs, ומייצר תלייה של ארבעה נוקלאוטידים.

נוכחותם של HAs בפלסמיד תיקון מנחה את התיקון התלוי בהומולוגיה שבו הקצה התלוי מתהפך ומשתמש ברצף ה- HA ההומולוגי כתבנית. סינתזת ה-DNA ממשיכה על ידי הוספת נוקלאוטידים משלימים לגן המטרה.

הפערים המתקבלים נקשרים, מה שמקל על החדרת הגנים. בנוסף, גן העמידות לאנטיביוטיקה ללא מקדם מתבטא ממקדם מארח במעלה הזרם של אתר ההחדרה. תאים שנערכו בהצלחה גדלים במדיום הברירה האנטיביוטית.

התחל בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במדיה hESC על צלחת בת 6 בארות המכילה מיטומיצין C, תאי הזנה הגדלים על ג'לטין. בכל יום לאחר הציפוי, עד שה-hPSC הגיע למפגש של 50%, השתמש בפיפטה מזכוכית ובוואקום כדי להסיר את כל נפח המדיה. החלף ב-3 מיליליטר של מדיית hESC חמה לכל באר.

יום אחד לפני המיקוד, הסר את מדיית ה-hESC והוסף מדיית hESC טרייה שחוממה מראש בתוספת 10 מיקרו-מולר Y27632. כמו כן, הכינו צלחות אחת עד שתיים של 6 בארות של תאי הזנה MEF עמידים לתרופות מעכברי DR4. ביום המיקוד, הכינו את תמיסות הטרנספקציה על ידי פיפטינג של 5 מיקרוגרם של ביטוי נוקלאז אצבע אבץ פלסמיד 1 ו-2 לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.

הוסף 30 מיקרוגרם של פלסמיד תורם התיקון, ואחריו מספיק 1X Phosphate Buffered Sa Salt כדי להביא את הנפח ל-300 מיקרוליטר. בדוק את התאים במיקרוסקופ כדי להבטיח מפגש של 50%. לאחר מכן, השתמש בפיפטה מזכוכית ובוואקום כדי להסיר את המדיה מהצלחת של hPSCs. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 2 מיליליטר PBS חם 1X. לאחר שאיבת ה-PBS, הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת EDTA של 0.25% טריפסין, ישירות על התאים.

מניחים בחממת תרבית הרקמות למשך כ-10 דקות, או עד ששכבת המזין מתחילה להתרומם מהצלחת. לאחר הדגירה, הוסף 2 מיליליטר של חומר esWash חם לכל באר כדי לעצור את תגובת הטריפסין. אסוף את התאים מכל באר, וודא שתאי ההזנה יורדים כסדין. פיפטה את תכולת כל באר לצינור חרוטי יחיד של 50 מיליליטר, המשלב את כל הבארות, וטריטורציה של התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.

הוסף מדיית esWash כדי להביא את מתלה התא ל-40 מיליליטר. המתן דקה עד שתיים כדי לאפשר לגושי הזנה גדולים להתיישב בתחתית הצינור, לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה סרולוגית, והפקיד בצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של תרחיף התא במשך חמש דקות ב-190 x גרם, שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. השעו מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר של 1X PBS.

שלב את התאים התלויים עם תמיסת העברת הפלזמה שהוכנה קודם לכן. יש לזרוק את תערובת התאים והטרנספקציה לקובטה של 4 מילימטרים, ולהניח על קרח למשך שלוש עד חמש דקות. הגדר את הפרמטרים עבור התוכנית האקספוננציאלית במערכת האלקטרופורציה ל-250 וולט, 500 מיקרו-פאראד, התנגדות אינסופית וגודל קובטה של 4 מילימטר. אלקטרופורציה של התאים, ולאחר מכן, הניחו את הקובט בחזרה על הקרח למשך שלוש דקות.

השעו מחדש את התאים האלקטרופורטיים ב-18 מיליליטר של מדיית hESC חמה בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y27632. בדוק את ה-DR4 MEFs תחת מיקרוסקופ. צלח 3 מיליליטר מהמתלה החד-תאי לכל באר של צלחת 6 בארות המכילה תאי הזנה DR4, והחזר לחממה. ביום השלישי לאחר הציפוי, החלף את המדיה על התאים במדיית hESC ללא Y27632. ביום הרביעי, יש להחליף את החומר ללא תוספת בחומר המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. כאן משתמשים בפורומיצין.