Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:34 דק׳ • July 8th, 2025
נוקלאז אצבע האבץ או ZFN מכיל תחום מאקרו מיוצב יון אבץ, קושר DNA המחובר לתחום אנדונוקלאז באמצעות מקשר. מבנה זה מסייע בשמירה על ספציפיות בעת חיתוך DNA.
כדי להשתמש ב-ZFNs לעריכת גנום, קחו תרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. השלם אותו עם פלסמיד המקודד ZFN. הוסף פלסמיד תיקון המכיל את גן המטרה ואת גן העמידות לאנטיביוטיקה הדחוס בין זרועות הומולוגיה או HAs. אלקטרופוראט את תערובת התא-DNA שבה הזרם החשמלי מקל על כניסת פלסמידים לתוך התא.
ברגע שנכנסים פנימה, מוטיבים של אצבעות האבץ של ZFN המתורגם נקשרים לשלישיות של זוגות בסיסים משלימים בגנום המארח, וממקמים נכון את אנדונוקלאז הגבלת Fok-1 באתר המטרה. ZFNs נקשרים לגדילים מנוגדים בזוגות ומאפשרים להומודימריזציה של Fok-1 ליצור מרכז קטליטי פעיל שבו Fok-1 מייצר שבירות דו-גדיליות של DNA או DSBs, ומייצר תלייה של ארבעה נוקלאוטידים.
נוכחותם של HAs בפלסמיד תיקון מנחה את התיקון התלוי בהומולוגיה שבו הקצה התלוי מתהפך ומשתמש ברצף ה- HA ההומולוגי כתבנית. סינתזת ה-DNA ממשיכה על ידי הוספת נוקלאוטידים משלימים לגן המטרה.
הפערים המתקבלים נקשרים, מה שמקל על החדרת הגנים. בנוסף, גן העמידות לאנטיביוטיקה ללא מקדם מתבטא ממקדם מארח במעלה הזרם של אתר ההחדרה. תאים שנערכו בהצלחה גדלים במדיום הברירה האנטיביוטית.
התחל בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במדיה hESC על צלחת בת
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים