JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:15 דק' • July 8th, 2025
ננו-להבים הם חלקיקים סינתטיים דמויי וירוס ללא החומר הגנטי הנגיפי העטוף, מה שהופך אותם לנשאים מתאימים למטען זר לתאי המארח. ננו-להבים אלה בנויים באמצעות הליבה הרטרו-ויראלית של נגיף הלוקמיה של העכבר המוקפת בקרום הדו-שכבתי השומני שמקורו בתאי היצרן האיקריוטיים המשמשים להרכבת ננו-להבים במבחנה.
הליבה מכילה את האנזים Cas9 המורכב עם ה-sgRNA הספציפי לרצף גנום המטרה. חלבוני הליבה מוקפים בחלבוני המעטפת המכילים תחום טרנסממברני או TM העובר דרך שכבת השומנים הדו-שכבתית. ה-TM מתחבר לתחום פני שטח גליקופרוטאינזי חוץ-תאי או SU הבולט מהמעטפת הדו-שכבתית.
כדי להשתמש בננו-להבים לעריכת גנים, קחו תרבית של תאי מטרה נצמדים והשלימו אותה עם תמיסת הננו-להבים. בתרבית, ה-SU הבולט של ננו-להב מזהה את הקולטן המתאים על פני התא המארח ונקשר אליו. זה מוביל לשינויים במבנה תחום ה-SU, מה שמקל על שחרורו.
שינויים אלה מעוררים את השינויים הקונפורמטיביים בתחום המדיטציה הטרנסנדנטלית, אשר נקשר לאחר מכן לקרום המארח. קשירה זו מביאה את הננו-להב קרוב לתא המארח, ומאפשרת היתוך של הממברנה הדו-שכבתית הנגיפית עם הממברנה המארח, והליבה הנגיפית נעה לתוך הציטופלזמה.
ברגע שנכנסים לתא, הליבה מתפרקת, ומשחררת את קומפלקס Cas9-sgRNA שיכול לבצע עריכת גנום באתר היעד שלו.
לצורך התמרה של תאי מטרה עם ננו-להבים, החלף את מדיום תרבית התאים ב-500 מיקרוליטר של המדיום המכיל ננו-להבים מטוהרים. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה בתאים, החלף את המדיום לכמות הרגילה של מדיום טרי.