אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:12 דק׳ • July 8th, 2025
כדי להזריק מיקרו DNA אקסוגני לעובר אנופלס, קח את המספר הרצוי של ביצי יתושים טריות, טרום-בלסטודרם. בשלב התפתחותי מוקדם זה, הביצית מכילה גרעינים מבלי ליצור מבנים תאיים.
הניחו את הביצים בצורת סירה בשולי נייר סופג לח הקיים על פני מגלשת זכוכית. שלב זה מבטיח הידרציה נאותה של העובר כדי להקל על ההזרקה בשלבים הבאים. יישר את הביצים הסמוכות זו לזו כשפני הגחון שלהן חשופים כלפי חוץ.
כעת, קח מחט מיקרו-הזרקה צרה המכילה את תמיסת הפלסמיד הרצויה. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי למקם את המחט ליד הקוטב האחורי של הביצית - אתר למבשרי תאי הנבט. הכנס את המחט בזווית מתאימה שהיא חודרת את האקסוכוריון - השכבה החיצונית - ואת האנדוכוריון - שכבה פנימית של קליפת הביצה - ובסופו של דבר מגיעה לעובר.
הזרקו את תערובת הפלסמיד לחלמון העובר. משוך בעדינות את המחט ואפשר לביצים לצמוח בתנאים מתאימים. ככל שהביצית גדלה, חלק מהגרעינים נודדים לקוטב האחורי, שם הם יכולים לשלב את המיקרו-דנ"א המוזרק. גרעינים אלה הופכים מאוחר יותר לגמטות - תאי המין שיכולים לגרום למוטציות תורשתיות בקו הנבט.
דמיין את היתושים הבוגרים לפנוטיפ שעבר טרנספורמציה - המאפיינים הנצפים בדורות הבאים המאשרים מיקרו-הזרקה מוצלחת.
השתמש בקצה מיקרו-מעמיס כדי למלא את המחטים בשני מיקרוליטר של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינור משאבת הלחץ האוטומטי. יישר את המחט כך שתיצור זווית של 15 מעלות עם מישור המגלשה.
פתח את קצה המחט על ידי נגיעה בזהירות בביצה הראשונה. לאחר מכן, הכנס את קצה המחט לכ-10 מיקרומטר בקוטב האחורי. הזרקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלזמה בתוך הביצית.
השתמש בבקרות השלב הקו-אקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצית הבאה כדי להמשיך בהזרקה. כדי להבטיח שקצה המחט יישאר פתוח ולא נסתם, לחץ על כפתור 'הזרק' לפני כניסה לעובר נוסף, ודמיין את הטיפה הקטנה בפתח המחט. אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור 'נקה' כדי לנקות את המחט, וחזור על בדיקת הדמיית הטיפות.
כוונן את הלחץ לפי הצורך, אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן. הזרקו כ-40 עד 50 ביצים עם מחט אחת. לאחר השלמת ההזרקות יש לשטוף את הביצים למיכל זכוכית מרופד בנייר פילטר ומלא ב -50 מיליליטר מים נטולי יונים.