טרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום: שיטה לשינוי גנטי של גנום האורז באמצעות גידולי אגרובקטריום מהונדסים גנטית

ניתן להנדס גנטית Agrobacterium tumefaciens, חיידק פתוגני צמחי, על ידי החדרת פלסמיד Ti שהוכן באופן מלאכותי, הנושא גן מעניין בהעברת ה-DNA או אזור ה-T-DNA שלו, ופלסמיד עוזר הנושא את הגנים האלימים או ה-Vir להעברת ה-T-DNA לתאי הצמח.

לטרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום, התחל עם תפרחת אורז צעירה וחתוך אותה לחתיכות קטנות. מעבירים את הייחורים למצע גידול ודוגרים כדי להקל על גידול הייחורים למסת תאים לא ממויינת הנקראת יבלת.

כעת, העבירו את היבלת למדיום חדירה של אגרובקטריום המכיל אצטוסירינגון - חומר כימואטרקטיבי לאגרובקטריום. לאחר מכן, הוסף תרבית של אגרובקטריום מהונדס גנטית למדיום ודגירה קצרה.

מולקולות האצטוסירינגון מפעילות את חלבון קולטן התא - VirA - על קרום האגרובקטריום, המתווך עוד יותר את הזרחן של חלבון מפעיל שעתוק - VirG. VirG זרחני נע לעבר הפלסמיד המסייע ומפעיל את השעתוק של מפל של גנים אלימים, כולל חלבוני תעלה ואנדונוקלאזות - VirD1 ו-VirD2.

חלבוני התעלה יוצרים תעלת הובלה המחברת בין תא החיידק לתא הצמח, ואילו האנדונוקלאזות נקשרות לרצפי הגבול בפלסמיד Ti ומבקעות את ה-T-DNA עם VirD2, הקשור בקצה אחד. לאחר מכן, VirD2 מכוון את כניסת T-DNA דרך תעלת ההובלה לתאי היבלות ומקל על שילובו בגנום האורז.

נגב כל תפרחת בעזרת ספוגית אלכוהול של 70%, ותן לה להתייבש לפני החיתוך. הביאו את התפרחת לספסל מעבדה סטרילי, וחתכו אותה לחתיכות קטנות בעזרת מספריים מעוקרים. לאחר מכן, העבירו את הייחורים לצלחת פטרי המכילה מדיום NBD2.

דגרו את הצלחת בחושך בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס, למשך 10 עד 14 ימים כדי לגרום ליבלת. כדי לבצע טרנספורמציה, העבירו מושבה בודדת מצלחת YEB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית ל-5 מיליליטר של מדיום YEB נוזלי המכיל את אותה אנטיביוטיקה, במבחנה סטרילית חרוטית של 50 מיליליטר. נער את הצינור על שייקר אורביטלי ב-250 x g ו-25 עד 28 מעלות צלזיוס עד שהחיידקים יגדלו ל-OD₆₀₀ של 0.5.

הוסף 1 מיליליטר של תרחיף חיידקים ל-100 מיליליטר של מדיום YEB עם אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית, בבקבוק חרוטי של 250 מיליליטר, ונער את הבקבוק על שייקר אורביטלי ב-250 x גרם, ו-28 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. צנטריפוגה את התרבית ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאסוף את החיידקים. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה עם מדיום AAM-AS, ודללו את המתלה ל-OD₆₀₀ של 0.4.

לאחר הדגירה, אספו כ-150 קאלי בריאים, צהובים בהירים, עובריים לבקבוק סטרילי של 150 מיליליטר. הוסף 50 עד 75 מיליליטר מתרחיף תאי החיידקים לתוך הבקבוק, ולאחר מכן הוסף 10 עד 25 מיליליטר של מדיום AAM-AS טרי, כדי לטבול את הקאלי למשך 10 עד 20 דקות, תוך ניעור מדי פעם.

שופכים את התרחיף החיידקי מהבקבוק בזהירות, ומייבשים את הקלי בנייר פילטר סטרילי. לאחר מכן, הניחו אותם על צלחת פטרי עם מדיום NBD-AS, וכסו אותם בנייר פילטר. דגרו על הקאלי בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך למשך שלושה ימים, ובדקו אם יש בהם צמיחת יתר של חיידקים.

לאחר שלושה ימים של גידול משותף, העבירו את הקאלי לצלחת פטרי סטרילית באמצעות נייר פילטר, ולאחר מכן יבשו אותם באוויר במשך שעתיים על ספסל נקי. ודא שהקלי אינו דבוק לנייר הסינון, והעבר אותם למדיום הבחירה הראשי NBD2.

לאחר שבועיים, העבירו את הקאלי באופן שווה לצלחת חדשה המכילה מדיום בחירה טרי. לאחר מכן, העבירו את הקאלי למדיום טרשת נפוצה טרי להתמיינות, ואת ניצני הנבטים למדיום טרשת נפוצה (עם 10 מ"ג/ליטר היגרומיצין) כדי להתרבות יותר נבטים.