אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:59 דק׳ • July 8th, 2025
להעברת DNA פלסמיד מבוססת אלקטרופורציה לתאי עצב ראשוניים, התחל בהשעיה של תאים באמצעי אלקטרופורציה מתאימים. הוסף DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי להכנת תערובת האלקטרופורציה.
העבירו בעדינות את תערובת האלקטרופורציה לקוביית אלקטרופורציה, הימנעו מבועות אוויר שעלולות להשפיע לרעה על יעילות האלקטרופורציה. העבר את הקובט למחזיק הקובט של האלקטרופורטור; הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה. התחל אלקטרופורציה.
הפולסים החשמליים הקצרים במתח גבוה המופעלים על פני קרום התא גורמים להצטברות מטען דיפרנציאלי משני צידי הממברנה, מה שמגדיל את הפוטנציאל הטרנסממברני, המתח על פני קרום התא.
כאשר פוטנציאל הטרנסממברנה המושרה עולה על פוטנציאל פירוק שכבת השומנים הדו-שכבתית, שכבת השומנים הדו-שכבתית מתערערת עם שינוי התצורה המקומי, ויוצרת נקבוביות הידרופיליות חולפות על קרום התא. הנקבוביות בגודל מתאים מספקות מסלול ל-DNA פלסמיד להיכנס לציטופלזמה של התא.
עם השלמת האלקטרופורציה, שכבת השומנים הדו-שכבתית אוטמת מחדש, משחזרת את שלמות קרום התא הדו-שכבתי, ובכך לוכדת את ה-DNA של הפלסמיד. יתר על כן, בשלב מחזור התא כאשר הממברנה הגרעינית, הממברנה הדו-שכבתית המקיפה את הגרעין, מתפרקת, DNA פלסמיד עובר לגרעין.
צלחת תאים אלקטרופורטיים לבארות המכילות מדיה של צלחת מרובת בארות עם כיסויים מצופים חלבון. דגירה כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי המצופה חלבון. תאים שהועברו בהצלחה המכילים DNA פלסמיד מבטאים את החלבונים הפלואורסצנטיים.
כדי להתחיל, הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית לכל קיר של צלחת התרבות בת 24 הבארות המכילה כיסויים מצופים, ושמור אותו חם ב-37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני. הכניסו את מספר התאים הנדרש לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר וסובבו ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של Opti-MEM. חזור על הליך זה פעמיים כדי להבטיח שאין שאריות של מדיום תרבית בצינור. הגדר את הפרמטרים של אלקטרופורציה כמפורט. פיפטה את תגובת האלקטרופורציה בעדינות כדי לערבב היטב, והשתמש בקצה פיפטה P200 ארוך כדי להעביר נפח מדויק של 100 מיקרוליטר מהתערובת לקוביית הרווח של שני מילימטרים.
לאחר שהקובטה נמצאת בתוך תא הקובטה, לחץ על כפתור האומגה של האלקטרופורטור, ושים לב לערך העכבה על ידי הקפדה על נפח מדויק של 100 מיקרוליטר. טווח ערכי העכבה צריך להיות בערך 30 ו-35.
לחץ על כפתור התחל כדי להפעיל את הדופק. רשום את ערכי הזרם הנמדדים ואת אבני החן המוצגים על מסגרת הקריאה. הסר את הקובטה מהתא.
הוסף מיד 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית מחומם מראש לקובטה, והשעיה אותה מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים-שלוש. העבירו מיד את מתלה התאים לצלחת 24 הבארות שהוכנה בעבר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני.