JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:23 דק' • July 8th, 2025
כדי להעביר פלסמידים לגרעיני ספורוזואיט על ידי נוקלאופקציה, התחל בהשעיה של ספורוזואיטים מבודדים וברי-קיימא - שלב תנועתי וזיהומי של טפילים - במאגר. ספורוזואיטים הם תאים בעלי צורה דקה המוקפים בקרום פלזמה חיצוני וקומפלקס ממברנה פנימית בסיסית המורכב מסדרה של שלפוחיות שטוחות וחלבונים החיוניים ליציבות מבנית ותנועתיות.
צנטריפוגה את התרחיף כדי לגלול את הספורוזואיטים. השעו מחדש את גלולת הספורוזואיט בנפח מתאים של מאגר טרנספקציה גרעינית, בתוספת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטי. מאגר טרנספקציה גרעינית עם יכולת חציצה גבוהה וחוזק יוני מבטיח טרנספקציה יעילה תוך שמירה על פונקציונליות ספורוזואיט.
העבר את המתלה לקובט טרנספקציה גרעינית. הנח את הקובט לתוך המחזיק של מכשיר נוקלאופקציה. הפעל את תוכנית הגרעין המתאימה.
במהלך נוקלאופקציה, המיושמים באופן ספציפי, פולסים קצרים במתח גבוה, יחד עם מרכיבי חיץ, משבשים באופן זמני את קרום הפלזמה ואת קומפלקס הממברנה הפנימית, ויוצרים נקבוביות טרנסממברניות, המספקות גישה לפלסמידים לציטופלזמה.
במקביל, שדות חשמליים בעלי חוזק גבוה אלה מפריעים גם לממברנה הגרעינית הדו-שכבתית המקיפה את הגרעין המפתח פערים חולפים, מה שמקל על כניסה ישירה של פלסמידים לגרעין, ללא צורך בחלוקת תאים.
לאחר השלמת הגרעין נקבוביות, נקבוביות הממברנה התאית והגרעינית נאטמות מחדש, ומחזירות את שלמות הממברנה וההומאוסטזיס תוך לכידת פלסמידים בתוך הגרעין.
הסר את הקובט מהמכשיר. הוסף מדיה מתאימה לשחזור ספורוזואיט והעבר לצינור טרי. ספורוזואיטים שנקלעו בהצלחה עם DNA פלסמיד מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים.
ראשית, צנטריפוגה של תרחיף הספורוזואיטים או המרוזואיטים ב-600 x גרם למשך 10 דקות, ולאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט. בסדר הבא, הוסף 85 מיקרוליטר של מאגר טרנספקציה גרעינית, 10 מיקרוגרם פלסמיד ו-25 יחידות של אנזים הגבלה לתוך הצינור של 1.5 מיליליטר המכיל ספורוזואיטים או מרוזואיטים. העבירו את המתלה לכוס טרנספקציה גרעינית.
הכניסו את הכוס לחריץ העברה גרעיני, הפעילו את מכשיר הגרעין באמצעות כפתור ההפעלה ובחרו בהליך הטרנספקציה U-033. בסיום התוכנית, לחץ על כפתור ה-X של התקן הגרעין, והמסך יציג אישור, המציין שהגרעין הצליח. הוסף 0.5 עד 1 מיליליטר של מדיום הנשר השונה של Dulbecco לכוס הגרעין כדי לעצור את התגובה.
לאחר ערבוב עדין, העבירו את המתלה לצינור של 1.5 מיליליטר.