העברת גנים לנטי-ויראליים בסיוע לייזר: טכניקה לחלחול ביציות מופרות של עכברים כדי להקל על העברת גנים לנטי-ויראליים

העברת גנים לנטי-ויראלית בסיוע לייזר היא טכניקה להעברת טרנסגן למערכת מארח.

כדי לייצר עכברים טרנסגניים, התחל עם ביצים מופרות עכברים מבודדות במדיום תרבית מתאים. מניחים את צלחת התרבית המכילה ביצית מופרית על במת מיקרוסקופ המותקנת מראש עם מכשיר לייזר ומחוברת לתוכנת בקרה. התבונן בהגדלה מתאימה.

ביציות מופרות מוקפות ב-zona pellucida, שכבת גליקופרוטאין מגנה החוסמת חלקיקים לנטי-ויראליים. כדי לחדור את המחסום הזה, הפעל את מכשיר הלייזר וודא שנורית הלייזר נראית מעל ה-zona pellucida. באמצעות תוכנת הבקרה, ירו את הלייזר. התאם את משך הירי בהתאם לקוטר הניקוב הרצוי.

מניחים את הביצים בחממה להתאוששות. לאחר דגירה קצרה, הסר את הביצים והוסף חלקיקי לנטי-וירוס הנושאים את הגן המעניין וסמן פלואורסצנטי לבחירה.

עם zona pellucida מחורר, נגיף הלנטי מתפזר בקלות לכיוון קרום תא הביצה ונכנס דרך אנדוציטוזיס. ה-lentivirus מתפרק ומשחרר את ה-RNA שלו, שכאשר הוא מעובד ברצף ל-DNA דו-גדילי, נכנס לגרעין המארח, ומשלב את הגנים הזרים בגנום המארח.

דגרו על הביצים ואפשרו להן להתפתח לבלסטוציסטים. השתל את הבלסטוציסטים בעכברים נקבות מזווגות. לאחר השלמת ההריון, שחזרו את הגורים ונתחו אותם לנוכחות טרנסגנית.

בזמן שהביצים נמצאות בחממה, הגדר וכייל את לייזר XYClone בהתאם להמלצות היצרן. כאשר הביצים מוכנות, הנח את צלחת הטיפה הראשונה על שלב מיקרוסקופ הלייזר, ומקד ידנית את ה-zona pellucida. לאחר אישור שאור ה-LED של הלייזר נראה דרך המטרה, הזז את שלב המיקרוסקופ כדי למקד את האזור עם לייזר ה-LED, והשתמש בתוכנת המחשב כדי להגדיר את לייזר XYClone ל-250 מיקרו-שניות.

התאם את גודל נורת ה-LED למידות המתאימות, ונקב את ה-zona pellucida של כל ביצה שלוש פעמים עם הלייזר כדי לייצר שלושה חורים של 10 מיקרומטר.

זה קריטי לבצע את הניקוב במהירות אך בזהירות, מכיוון שהביצים המופרות אינן יכולות להישאר מחוץ לחממה יותר מ-15 דקות.

לאחר מכן, החזירו את הביצים המחוררות לחממה למשך שעתיים נוספות. בתום הדגירה השנייה יש לטפל בטיפת KSOM בנפח 50 מיקרוליטר עם 2 מיקרוליטר של נגיף לנטי מרוכז ללא ערבוב, ולהחזיר את הביצים לחממה למשך ארבעה ימים. כאשר הביציות התפתחו לבלסטוציסטים, השתמש במכשיר העברת עוברים לא ניתוחי כדי להפקיד כ-10 עד 15 עוברים בכ-2 מיקרוליטר של KSOM.

17 יום לאחר החזרת העוברים, אפשר לעכברה ההרה להמליט באופן טבעי או לאסוף את היילודים בניתוח קיסרי לפי הצורך.