העברת גנים בתיווך ביולוגי: טכניקה להעברת גן מעניין בתאי מטרה באמצעות אקדח גנים ביוליסטי

התחל עם נפח אופטימלי של חרוזי זהב - כלי העברת גנים אינרטיים ביולוגית ולא רעילים - בצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף חומרים קטיוניים - ספרמידין וסידן כלורי, ואחריהם את שברי ה- DNA הרצויים לחרוזי הזהב. העבירו בעדינות את הצינור ודגרו.

סידן כלורי נקשר לשברי ה-DNA ומקל על ציפוים על חרוזי זהב באמצעות שאריות ספרמידין. לאחר מכן, צנטריפוגה והסר את הממס. השעו מחדש את החרוזים המצופים ב-DNA באתנול. פיפטה בעדינות את החרוזים על דיסק מקרו-נשא סטרילי. תן לזה להתייבש.

הקימו מנגנון אקדח גנים ביוליסטי הכולל צינור תאוצה של גז הליום ותא הפצצה עם דיסק קרע ומסך עצירה בחריצים שלהם. לאחר מכן, הפוך את דיסק המקרו וטען אותו מתחת לדיסק הקרע.

לאחר מכן, הנח את תאי מארח המטרה בתרבית במדיום מוצק מתאים בתוספת סורביטול - מייצב אוסמוטי לשיפור יעילות הטרנספורמציה. לאחר שההתקנה מוכנה, ירה באקדח הגנים.

כאשר הליום נע במורד צינור התאוצה, הלחץ ממשיך להצטבר עד שדיסקת הקרע נשברת, ויוצר גלי הלם של הליום. גלי ההלם האלה מניעים את דיסק המקרו-נושא הנושא חרוזי זהב לעבר מסך העצירה, שמאפשר רק לחרוזי הזהב לעבור.

חרוזי הזהב המואצים חודרים לגרעין התא המארח, ומשלבים את ה-DNA הרצוי בגנום התא המארח.

התחל בשימוש במלקחיים כדי לטבול דיסקים ביוליסטיים כתומים ב-100% אתנול, ולאחר מכן, העביר את הדיסקים לצלחת פטרי גדולה המכילה יבש, תוך הקפדה שהדיסקים לא ייגעו בחומר הייבוש. לאחר הייבוש, לחץ את הדיסקים לתוך מחזיקי דיסק כסף מנוגבים באתנול, ולאחר מכן, מערבל שפופרת של חרוזי זהב, ומכניס 12 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 1.5 מיליליטר לכל טרנספורמציה.

לאחר מכן, הוסף ברצף 2 מיקרוגרם DNA, 10 מיקרוליטר סידן כלורי ושני מיקרוליטרים של בסיס נטול ספרמידין לכל צינור חרוזים. מערבולת כל דגימה לאחר מכן, דגירה על הצינורות בטמפרטורת הסביבה למשך 5 דקות, עם תנועות עדינות מדי פעם כדי להשעות מחדש את החרוזים המיושבים.

בתום הדגירה, גלו את חרוזי הזהב המצופים ב-DNA, ושאבו בזהירות את הסופרנטנט. השעו לאט את החרוזים לחלוטין ב -600 מיקרוליטר של 100% אתנול, ואז, גלו שוב את התאים, הפעם השעו מחדש את החרוזים ב -8 מיקרוליטר אתנול.

כעת חלקו כל שפופרת של חרוזים על מרכז הדיסק הביוליסטי הבודד במעגלים בקוטר 1 סנטימטר. אם קיים ריכוז מספיק של חרוזים, עיגול זהב ייראה במרכז כל דיסק לאחר שהחרוזים יבשים.

כדי להפעיל את אקדח הגנים, ראשית, הפעל את משאבת הוואקום, ולאחר מכן סובב את כפתור מיכל ההליום נגד כיוון השעון עד שמגיעים ללחץ של כ-2200 PSI על מד הלחץ. לאחר מכן, סובב את המתג האדום השמאלי כדי להפעיל את אקדח הגנים, והתאם את קצב הזרימה עבור הוואקום והאוורור כך שהוואקום יגיע ל-28 אינץ' כספית תוך 15 שניות. ודא שהמרחק בין דיסק הקרע לנושא המאקרו הוא בערך 3/8 אינץ' גם בשלב זה.

כשהכל במקומו, נגב את כל החדר עם 70% אתנול, וטבל את דיסקי הקרע ב-100% אתנול. לאחר ייבוש הדיסקים על משטח סטרילי, השתמש במפתח מומנט כדי לשחרר את מחזיק דיסק הקרע והכנס דיסק נקי. הברג את מחזיק דיסק הקרע בחזרה למקומו, וסובב אותו פעם אחת ימינה עם מפתח המומנט כדי להדק אותו.

לאחר מכן, טבלו את מסכי הרשת ב-100% אתנול. לאחר הייבוש, הנח מסך על לוחית ההרכבה מפלסטיק לבנה, והנח את מחזיק הדיסק הנושא, צד ה-DNA כלפי מטה, לתוך תא הדיסק. הברג את מכסה הכסף והנח את לוחית ההרכבה בחריץ הגבוה ביותר, ולאחר מכן, הנח צלחת אגר YPD המכילה סורביטול מולארי אחד על הצלחת התחתונה.

כעת סגור את דלת החדר ונעל אותה במקומה, ולאחר מכן, לחץ והחזק את המתג האדום האמצעי במצב למעלה כדי להפעיל את הוואקום, ולאפשר לו להגיע ל-28 אינץ' כספית. לאחר הגעה לרמת הוואקום המתאימה, והמתג האמצעי הועבר למצב למטה, החזק את המתג האדום הימני לחוץ כדי לירות.

כאשר דיסק הקרע קופץ, שחרר מיד את לחצן האש ולחץ על המתג האדום האמצעי למצב האמצעי על מנת לאוורר את החדר ל-0 PSI. אם הזריקה הצליחה, טבעת זהב תהיה גלויה על הצלחת. נקה את דיסק הקרע ואת פסולת דיסק המקרו, וכבה את אקדח הגנים, ולאחר מכן, סובב את כפתור מיכל ההליום בכיוון השעון כדי לכבות את הגז ולכבות את משאבת הוואקום.