אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:10 דק׳ • July 8th, 2025
תאי שריר חלק בכלי הדם, או VSMCs, הם המרכיבים התאיים הבולטים בתקשורת הטוניקה - השכבה האמצעית של דופן כלי הדם. בתגובה לרמזים פתולוגיים או להזדקנות, תאים אלה מתווכים הסתיידות כלי דם - תופעה של הצטברות סידן במטריקס החוץ-תאי.
קח צלחת מרובת בארות המכילה שכבה דביקה של תרבית VSMC אבי העורקים העכברי שהסתייד מראש. דגרו על התאים בתמיסת פורמלין כדי להצליב חלבונים תאיים, ולייצב את מבנה ה-VSMC לפני הצביעה.
התחל את צביעת פון קוסה על ידי שאיבת פורמלין מהבאר, והוספת תמיסת כסף חנקתי. דגרו את הצלחת מתחת למקור אור מתאים.
ברגע שתמיסת חנקת הכסף מגיעה לאתרי ההסתיידות במטריצה החוץ-תאית של שכבת ה- VSMC, יוני הכסף מחליפים את יוני הסידן הקשורים לפוספט. התוצאה היא צבע צהוב חולף. בנוכחות חומר אורגני ואור, הפירוק הפוטוכימי של פוספט כסף מביא להיווצרות כסף מתכתי בצבע שחור.
השלך את הכמות המקסימלית של תמיסת כסף חנקתי שהוצאה. טפל בתאים בתמיסת נתרן תיוסולפט. פתרון זה ממיר שאריות מלחי כסף לקומפלקס מסיס במים, אותו ניתן להסיר באמצעות שטיפה אחרונה במים, ולשפר את ניגודיות הכתמים.
דמיין את התאים המוכתמים כדי לאתר את המשקעים השחורים הבלתי מסיסים המעידים על הסתיידות.
כדי לגרום להסתיידות בתאי שריר חלק בכלי הדם, העבירו את התאים לצלחת התרבות בעלת שש הבארות, ואפשרו להם להיצמד. לאחר מכן, הזינו מחדש את התאים באמצעי הסתיידות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים לפחות. לאחר מכן, שאפו את המדיה מצלחת תרבית התאים. שוטפים את התאים פעם אחת במים נטולי יונים.
תקן את התאים על ידי הנחתם במיליליטר אחד של 10% פורמלין בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר את הפורמלין ושטוף את התאים הקבועים במים מזוקקים למשך 5 דקות.
לאחר מכן, דגרו את התאים ב -1 מיליליטר של תמיסת חנקת כסף 5% מתחת לנורה של 60 עד 100 וואט למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, שאפו את תמיסת חנקת הכסף, ושטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, הסר את הכסף שלא הגיב על ידי הנחת התאים ב-1 מיליליטר של תמיסת נתרן תיוסולפט 5% במים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר מכן יש לשטוף את התאים במים מזוקקים למשך 5 דקות. התאים הצבועים בפון-קוסה מוכנים כעת להדמיה במיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי.