JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:50 דק' • July 8th, 2025
לצביעה שלילית של נגיפים עטופים, התחל עם התרחיף הנגיפי הרצוי. דגרו על הנגיפים עם גלוטרלדהיד, מקבע כימי. עם החדירה, גלוטראלדהיד מקשר בין החלבונים הנגיפיים וחומצות הגרעין, מנטרל וירוסים תוך שמירה על המורפולוגיה, ובכך מקל על טיפול בטוח בנגיף. מעבירים את התערובת הזו לצלחת מרובת בארות.
חבר מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, TEM, רשתות המכילות קפסולה לפיפטה באמצעות מצמד. בעזרת הפיפטה, שאבו את תערובת קיבוע הנגיף לתוך הקפסולה. דגרו את מכלול הפיפטות כדי שנגיפים יספגו על משטחי הרשת.
הסר את התערובת. שטפו את הקפסולה, הסירו נגיפים ומקבעים שאינם דבקים. פיפטה תמיסה של אורניל אצטט, כתם על בסיס מתכת כבדה, לתוך הקפסולה. דגירה כדי לאפשר לכתם ליצור קשר עם הנגיפים.
יוני אורניל נקשרים לגליקופרוטאינים ספציפיים של הממברנה ולפוספוליפידים על משטחים נגיפיים. יונים יכולים לחדור לנגיפים ולהיקשר לחלבוני הנוקלאוקפסיד הסוגרים את הגנום. קשירה זו גורמת להצטברות ושקיעה של יונים ממתכות כבדות סביב הנגיף ומבנים נגיפיים ספציפיים.
הפרד את הקפסולה. הסר עודפי כתם מהרשתות וייבש באוויר.
במהלך הדמיית TEM, אלומות אלקטרונים בעלות אנרגיה גבוהה חוצות את הנגיף, וגורמות לאזורים המוכתמים בצפיפות האלקטרונים של הנגיף לפזר יותר אלקטרונים. עם זאת, צפיפות האלקטרונים הנמוכה הכוללת של הנגיף מאפשרת לאלקטרונים לעבור. מערכת ההדמיה מעבדת את האלקטרונים המפוזרים באופן שונה, ומייצרת תמונה בעלת ניגודיות גבוהה.
נגיפים מוכתמים שלילית נראים בהירים יותר עם נוקלאוקפסיד כהה על גבול כהה, מה שמקל על הדמיה אולטרה-מבנית.
כדי להתחיל, ערבבו את תרחיף הנגיף בנפח שווה של 4% גלוטראלדהיד כדי להשיג ריכוז סופי של 2% גלוטראלדהיד. באמצעות תיקון, השבת את הווירוס למשך 24 שעות לפחות. לטהר את הצינור ולהעביר אותו למתקן BSL2-EM.
לאחר מכן, חבר לכידה טעונה ברשת לפיפטה. שואבים את התערובת לתוך הכמוסה. הניחו את הפיפטה על צדה כשהרשתות מכוונות אופקית למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הרימו את הפיפטה והוציאו את תערובת הנגיפים למיכל פסולת. שאפו 40 מיקרוליטר מים נטולי יונים לתוך הקפסולה, ולאחר מכן השליכו את המים למיכל פסולת. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים.
לאחר מכן, שאפו 40 מיקרוליטר של 1% UA או 1% PTA לתוך הקפסולה למשך 30 שניות. הסר את הקפסולה מהפיפטה. בעזרת נייר פילטר, יבש את הרשתות, ולאחר מכן אפשר לרשתות להתייבש באוויר.