צביעת מתילן כחול להערכת היווצרות מושבה גרורתית במבחנה: הליך צביעה להערכת גרורות על ידי כימות תאי סרטן שנקטפו ממודל עכבר סרטני

במהלך גרורות סרטניות, תאי גידול מגידול ראשוני עוברים דרך מערכת הדם, יוצאים לאיברים מרוחקים ויוצרים גידולים משניים.

כדי להעריך גרורות ריאה במודל עכבר סרטן שד שהוזרקו לו תאי 4T1, תאי סרטן שד גרורתיים מאוד, הכינו תרחיף תאים, כולל תאי 4T1, שבודדו מהריאות שנקטפו. צנטריפוגה את המתלה והשעיה מחדש של התאים במדיה המכילה 6-תיוגואנין, 6-TG - אנלוגי גואנין. זרע את תרחיף התאים בצלחת תרבית.

6TG נכנס לתאים נורמליים שבהם אנזים טרנספראז ספציפי ממיר אותו לנוקלאוטיד 6-TG, נוקלאוטיד רעיל. נוקלאוטידים ציטוטוקסיים אלה משולבים ב-DNA, גורמים לנזק ל-DNA, ומסלקים באופן סלקטיבי תאים מהתרבית. לתאי 4T1 יש יכולת מופחתת ליצור נוקלאוטידים רעילים, מה שמקל על הישרדותם והיצמדות לצלחת. בהתאם ליכולת ההתפשטות של התאים, הם יוצרים מושבות.

טפל בתאים במתנול. מתנול מחלחל לתאים ומנטרל את החלבונים התאיים. דגרו את התאים עם מתילן כחול.

הצבע הטעון חיובית נכנס לתא, מקיים אינטראקציה עם ה-DNA הטעון שלילית, ומתחבר לחללים בין זוגות הבסיסים הסמוכים של גדילי ה-DNA. זה גם נקשר ל-RNA בציטופלזמה, אך עם זיקה נמוכה יותר. הגרעינים צובעים בכחול כהה בגלל ריכוז DNA גבוה מאשר הציטופלזמה בגלל ריכוז ה-RNA הנמוך. מושבות גרורתיות מופיעות כנקודות כחולות.

דמיינו את הצלחת. השתמש בתוכנה כדי לקבוע את המושבות הגרורתיות, לכמת את העומס הגרורתי בריאות העכבר.

הביאו את נפח הצינור עד 10 מיליליטר עם 1X HBSS. לאחר מכן, שפכו את התוכן על מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר. השתמש בבוכנה של מזרק של 1 מיליליטר כדי לטחון בעדינות את הדגימה דרך המסננת.

צנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות ב-350 פעמים גרם, והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את הגלולה פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X HBSS. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של 60 מיקרו-טוחנות 6-Thioguanine אמצעי תרבית שלמים, וצלחו את הדגימות בלוחות תרבית תאים של 10 סנטימטר באמצעות ערכת דילול, אם תרצה.

דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 5 ימים. שופכים את אמצעי התרבות מהצלחות למיכל הפסולת המתאים. כדי לתקן את התאים, הוסיפו 5 מיליליטר מתנול לא מדולל לכל צלחת, ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והקפידו לסובב את המתנול כך שיכסה את כל הצלחת.

שופכים את המתנול מהצלחות למיכל הפסולת המתאים, ולאחר מכן שוטפים כל צלחת ב -5 מיליליטר מים מזוקקים. מוסיפים 5 מיליליטר של 0.03% מתילן כחול לצלחת, ומדגרים אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, תוך הקפדה לסובב את תמיסת המתילן הכחולה כך שתכסה את כל הצלחת. שופכים את המתילן הכחול למיכל הפסולת המתאים, ושוטפים כל צלחת שוב עם 5 מיליליטר מים מזוקקים.

הפוך את הצלחת הפוך ומחק אותה במגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. הניחו את הצלחת על המכסה שלה ותנו לה להתייבש באוויר למשך הלילה. מושבות גרורתיות יהיו כחולות. לאחר שהתייבשו הצלחות, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.