צביעת תאים: טכניקת מבחנה לזיהוי רמות גליקוגן בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, או PBMCs, הם תאי דם במחזור הדם עם גרעינים בודדים וגדולים, הכוללים לימפוציטים B ו-T, תאי הרג טבעיים, מונוציטים ותאים דנדריטים. PBMCs מאחסנים עודפי גלוקוז בצורה פולימרית כגליקוגן - פוליסכריד מסועף - בציטופלזמה שלהם.

כדי לזהות נוכחות גליקוגן ב-PBMCs, הכינו מריחה אחידה של PBMCs מבודדים על שקופית זכוכית. טפלו בתאים בפורמלין - תמיסה מקבעת, המקשרת בין ביומולקולות תאיות, ושומרת על השלמות המבנית של PBMCs.

טבלו חלקית את השקופית בתמיסת עמילאז. אנזים זה נכנס לתאים ועושה הידרוליזה של גליקוגן בתאים המטופלים. התוצאה היא שתי אוכלוסיות תאים נפרדות - תאים שטופלו באנזימים, חסרי גליקוגן ותאים עשירים בגליקוגן שאינם מטופלים בעמילאז.

מכסים אותם בתמיסת חומצה תקופתית הממירה באופן חמצוני את קבוצות ההידרוקסיל של מולקולות הגליקוגן לאלדהידים.

שטפו את השקופית במים כדי לעצור את תגובת החמצון ולהסיר עודף חומצה תקופתית. טפל בשקופית עם מגיב שיף, המגיב עם קבוצות האלדהיד של גליקוגן תקופתי שטופל בחומצה, ויוצר קומפלקס בצבע מג'נטה בלתי מסיס.

החל אמצעי הרכבה כדי לרסן תאים במהלך ההדמיה. הנח כיסוי כדי לפזר את מדיית ההרכבה על פני כל משטח השקופית להדמיה טובה יותר. דמיין את התאים המוכתמים.

תאים שאינם מטופלים בעמילאז מכילים גרגירי גליקוגן מג'נטה, הנעדרים בתאים שטופלו באנזימים.

בשלב זה, הנח את השקופית על משטח ישר. מרחו 2 מיליליטר של תמיסת חומצה תקופתית על הדגימה, ודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופית מספר פעמים במים מזוקקים. מרחו 2 מיליליטר של המגיב של שיף על השקופית, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו את המגלשה במים מזוקקים למשך 5 דקות, ולאחר מכן השאירו אותה לייבוש באוויר. לאחר מכן, יש למרוח מדיית הרכבה של 100 מיקרוליטר על המגלשה, ולכסות אותה בכיסוי אחד גדול, או למרוח 50 מיקרוליטר ולהשתמש בשני כיסויים קטנים. לאחר מכן, מרחו לק שקוף על שולי הכיסוי. תן להם להתייבש למשך הלילה.

לאחר מכן, השג תמונות עם מיקרוסקופ האור הדו-עיני באמצעות המטרה 100X.