צביעה כחולה טולוידין של קטעי עצב היקפיים: טכניקה להכתמת סיבי עצב מיאלינים להדמיית מבנה עצב היקפי

עצבים היקפיים מורכבים מאקסונים המוקפים בתאי שוואן העוטפים את האקסונים בשכבות מרובות של קרומי תאים עשירים בשומנים, ויוצרים את מעטפת המיאלין.

כדי לדמיין עצבים היקפיים, התחל עם שקופית זכוכית הנושאת קטע עצב היקפי רוחבי של חולדה קבועה, משובצת שרף, שטופלה באוסמיום טטרוקסיד. חלקים משובצים בשרף מסייעים בשמירה על מורפולוגיה של רקמות.

טיפול באוסמיום טטרוקסיד גורם לתצהיר של אוסמיום מתכתי בשכבת השומנים של מעטפת המיאלין באתר הרקמה.

תמיסת פיפטה אלקליין של כחול טולואידין מעל קטע הרקמה. יבש את השקופית בטמפרטורה מתאימה. התנאים האלקליין והחום מקלים על חדירת כחול טולואידין דרך השרף לחלק הרקמה.

כחול טולואידין, בהיותו צבע קטיוני, נקשר לקבוצות הפוספט הטעונות שלילית ב- DNA וגם מתערבב בין זוגות בסיסי ה- DNA בגרעיני תאי שוואן. בנוסף, הצבע נקשר ל-RNA בציטופלזמה, מחוץ למעטפת המיאלין.

הוסף תמיסת הרכבה מעל קטע העצב המוכתם וכסה בכיסוי כדי להכין את הרקמה להדמיה. תחת מיקרוסקופ אור, שכבות מעטפת המיאלין נראות שחורות עם מבנים מוגדרים של סיבי עצב מיאליניים לאחר טיפול באוסמיום, בעוד האקסונים נשארים לא מוכתמים.

גרעיני תאי שוואן וציטופלזמה מופיעים בגוונים שונים של כחול בשל התכונה המטאכרומטית של הצבע, מה שמקל על הדמיה של מורפולוגיה של אקסון ומידת המיאלינציה בעצבים היקפיים.

כדי להכתים את קטעי העצב, השתמש בפיפטה מפלסטיק או במיקרו פיפטור כדי להוסיף טיפה של תמיסת טולואידין כחולה בחלק העליון של חלקי העצב. לאחר 20 עד 30 שניות, שטפו את כל עודפי התמיסה הכחולה של טולואידין, על ידי טבילה עדינה של השקופיות בצנצנת מים נטולי יונים, וחזרו על הפעולה 3 עד 4 פעמים עד שהחלקים נקיים.

יבש את השקופיות לפחות 15 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס, או לילה בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש יש להוסיף אמצעי הרכבה רגיל ולכסות את החלקים בכיסוי. לבסוף, בדוק את החלקים המותקנים תחת מיקרוסקופ אור. עדשת טבילה בשמן 100X מומלצת לתמונות מפורטות לחישוב יחסי g.