JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:32 דק' • July 8th, 2025
באוכלוסיית תאי גידול הטרוגנית, טיפול בתרופה אנטי-סרטנית יהרוג את רוב התאים, אך תאים עמידים לתרופות שורדים, וכתוצאה מכך כישלון טיפולי.
כדי לקבוע את שיעור התאים העמידים לתרופות, זרע אוכלוסיית תאי גידול הטרוגנית בצלחת מרובת בארות. דגירה כדי להקל על היצמדות התאים. הוסף ריכוז הולך וגדל של תמיסת תרופה אנטי סרטנית מתאימה.
אינטראקציה עם מולקולות תרופות גורמת לתאים רגישים למות וכתוצאה מכך להתנתק מלוחות התרבית. לעומת זאת, תאים עמידים לתרופות שורדים ונשארים מחוברים לצלחת.
שאפו את המדיה המושקעת כדי להסיר את התאים המנותקים. הוסף מדיה טרייה ללא תרופות ודגר את הצלחת בתנאים פיזיולוגיים. התאים העמידים לתרופות מתרבים ויוצרים מושבות גידול. כעת, הוסיפו תמיסת צביעה סגולה קריסטל למושבות ודגרו.
סגול קריסטל, כתם בצבע סגול, חדיר לממברנה, טעון חיובית, נכנס לתאים וקושר חלבונים אניוניים ו- DNA, ובכך מעניק צבע סגול לתאים.
לאחר מכן, הוסף אתנול כדי להמיס את הכתם שלא הגיב. שטפו כדי להסיר כתם עודף וייבשו את הצלחת באוויר.
מושבות עמידות לתרופות מופיעות כנקודות סגולות. ספרו את מספר המושבות הצבעוניות בכל באר. מייצגים את אחוז כדאיות התאים בגרף כדי לקבוע את שיעור תאי הסרטן העמידים לתרופות בכל ריכוז תרופה.
בהליך זה, צלחת 2000 תאים, תוך שימוש ב -2 מיליליטר מדיה לבאר, בצלחות 6 הבארות. לאחר 24 שעות, הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של דוסטקסל עבור קווי תאים DU145 ו-22Rv1. הוסף DMSO רק לבאר אחת כפקד באותו נפח המשמש למינון הגבוה ביותר של Docetaxel.
לאחר 72 שעות, שאפו את המדיה המכילה תרופה, והוסיפו מדיה טרייה ללא דוסטקסל. דגרו על הצלחות למשך שבוע עד שבועיים, עד שהמושבות נראות במיקרוסקופ.
כדי להכתים את המושבות, יש לשטוף אותן בעדינות עם 2 עד 3 מיליליטר PBS, ולדגור אותן עם שניים עד שלושה מיליליטר תמיסת סגול קריסטל למשך 20 דקות, בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות או מכסה אדים. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה, ושטוף את הצלחות עם 2 עד 3 מיליליטר מים. לאחר מכן, הסר מים וייבש את הצלחות באוויר.
צלם תמונות דיגיטליות של הלוחות לייצוג דמויות. נתח את התוצאה על ידי הדמיית הבארות, וספירה ידנית של המושבות בעזרת עט טוש.