צביעת כסף פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת סך החלבון בג'ל פוליאקרילאמיד

צביעת כסף פלואורסצנטית של חלבונים בג'לים פוליאקרילאמיד משתמשת בבדיקות פלואורוגניות כדי לזהות ולכמת את החלבונים.

התחל עם ג'ל פוליאקרילאמיד עם חלבונים, מופרדים לרצועות באמצעות אלקטרופורזה. משרים בתערובת מקבעת של אתנול וחומצה אצטית, המונעת מהרצועות להתפזר על ידי דנטורציה של החלבונים.

שטפו את הג'ל כדי להסיר שאריות חומצה אצטית ואתנול. טבלו את הג'ל בכתם חנקתי כסף. יוני כסף נקשרים חזק לקבוצות טעונות שלילית בחלבונים.

דגירה בחושך. שטפו את הג'ל במים טהורים במיוחד כדי להסיר קומפלקסים של יוני כסף לא קשורים.

טבלו את הג'ל בתמיסה מתפתחת המכילה בדיקה פלואורוגנית רב-רכיבית - TPE-4TA. בדיקה אניונית זו מכוונת ליוני כסף הקשורים לחלבון, ויוצרים אגרגטים בלתי מסיסים המפעילים את התכונות הפלואורוגניות של הגשושית, ובכך מקנים פלואורסצנטיות.

מכיוון שהפעלת הקרינה תלויה בצבירה, הבדיקות הלא קשורות אינן פולטות שום אות, מה שמאפשר צביעת חלבון כוללת עם פליטת רקע מופחתת.

דגרו את הג'ל בחושך בתסיסה עדינה, מה שמבטיח התפתחות פלואורוגנית מלאה. העבירו את הג'ל במאגר דיסטנט כדי להסיר בדיקות לא קשורות. לבסוף, דמיין את הג'ל כדי להשיג את עוצמת אות הלהקה. שרטט את עוצמת אות הקרינה מול עקומת החלבון הסטנדרטית כדי לחשב את הכמות הכוללת של חלבונים בדגימה.

לאחר האלקטרופורזה, יש לטבול את הג'ל בתמיסה של 100 מיליליטר המכילה אתנול וחומצה אצטית על שייקר אורביטלי, ולדגור פעמיים למשך 30 דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר תוך ניעור ב-50 סל"ד. לאחר מכן, שטפו את הג'ל שלוש פעמים במים טהורים במיוחד בכלי נקי, כאשר כל שטיפה נמשכת 10 דקות.

ראשית, ממיסים 0.01 גרם חנקת כסף ב -10 מיליליטר מים טהורים במיוחד להכנת תמיסת מלאי בריכוז של 0.1%. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת מלאי זו ל-100 מיליליטר של מים טהורים במיוחד כדי ליצור את תמיסת העבודה של חנקת הכסף. במכסה אדים, טבלו את הג'ל ב 100 מיליליטר מתמיסת העבודה של חנקת הכסף בתא זכוכית אטום.

השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן על הג'ל מפני אור במהלך ההספגה, ודגירה למשך שעה תוך כדי טלטול ב-50 סל"ד על שייקר מסלול. לאחר מכן, יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים טהורים במיוחד בכלי נקי, כאשר כל שטיפה משתמשת בכ-100 מיליליטר מים ונמשכת 60 שניות.

חשוב להשתמש במים טהורים במיוחד לניקוי הג'ל לאחר שלב הספגת הכסף כדי למזער כתמי רקע.

ראשית, הוסף 50 מיליליטר מים טהורים במיוחד ל-3 מיליגרם של צבע TPE-4TA. סוניקציה של התמיסה למשך 3 דקות, והוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת בין כל מפגש סוניקציה, כדי לסייע בהמסת הצבע, בדרך כלל עד שלוש פעמים. לאחר מכן, בדוק את הקרינה של התמיסה מתחת למנורת UV של 365 ננומטר כדי לוודא שהצבע מומס במלואו. רק תמיסות חלשות או לא פולטות מעידות על פירוק מלא.

כדי להכין את תמיסת הפיתוח הפלואורוגנית, הוסף 10 מיליליטר מתמיסת המלאי TPE-4TA ל-90 מיליליטר מים טהורים במיוחד. השתמש במד pH כדי לבדוק את ה-pH של התמיסה. כוונן את התמיסה ל-pH בין 7 ל-9, באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסיד מדוללת או חומצה אצטית, אם ה-pH נמצא מחוץ לטווח.

לאחר מכן, העבירו את הג'ל למיכל נקי ואטום עם 100 מיליליטר של תמיסת הפיתוח הפלואורוגנית, וודאו שהג'ל שקוע לחלוטין. אטמו את המיכל וכסו אותו כדי להגן עליו מפני אור. יש לנער את המיכל למשך הלילה על שייקר מסלולי ב-50 סל"ד ובטמפרטורת החדר.

מעבירים את הג'ל לכלי נקי, ומכתימים אותו ב 100 מיליליטר של 10% אתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את הג'ל במים טהורים במיוחד למשך 5 דקות. ניתן לדמיין את הג'ל על גבי טרנס-תאורה על שולחן, או לצלם אותו במכונת תיעוד ג'ל בערוץ 365 ננומטר או בערוץ 302 ננומטר.