צביעת פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט: טכניקה במבחנה לזיהוי אוסטאוקלסטים בתרבית המכילים אנזים TRAP

אוסטאוקלסטים הם תאים גדולים, בצורת כיפה, מרובי גרעינים הנמצאים על פני העצם. תאים אלה מכילים גרגירים ציטופלזמיים רבים העשירים בחומצה עמידה לטרטרט, או TRAP - אנזים מטאלופרוטאין המופרש מהגבול המסולסל של האוסטיאוקלסטים לרקמת העצם. אנזים זה מעכל את המטריצה החוץ-תאית וממיס את גבישי המינרלים, מה שמקל על ספיגת העצם.

כדי לזהות גרגירי TRAP כסמנים ציטוכימיים של אוסטאוקלסטים, קח צלחת תרבית המכילה אוסטאוקלסטים דבקים. הוסף תמיסת צביעה TRAP לתאים. תמיסה זו כוללת את המצע - נגזרת נפתול המכילה פוספט וחומצה טרטרית במאגר בתוספת מלח דיאזוניום.

הוסף חומצה אצטית לתמיסה זו כדי לשמור על ה-pH החומצי הדרוש לצביעה של TRAP. דגרו את התאים בחושך בטמפרטורה פיזיולוגית לפעילות אנזימית TRAP אופטימלית.

תמיסת הצביעה נכנסת לאוסטאוקלסטים, שם החומצה הטרטרית מעכבת את פעילות ההידרוליזה של פוספטאזות חומצה רגישה לטרטרט בתאים אחרים.

במקביל, TRAP מבצע הידרוליזה של המצע הנוסף כדי להסיר את קבוצת הפוספט שלו. המצע שעבר הידרוליזה מתחבר עם מלח דיאזוניום מתמיסת הצביעה ליצירת קומפלקס צבע בלתי מסיס בצבע חום. קומפלקס זה משקע כגרגירים באתרי הפעילות האנזימטית.

דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ. התצהיר של גרגירי צבע חום בתוך הציטופלזמה מאשר את נוכחותם של אוסטאוקלסטים המכילים TRAP בתרבית.

בשלב זה, שאפו את המדיום, ושטפו את הדגימה בעדינות שלוש פע