צביעת פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט: טכניקה במבחנה לזיהוי אוסטאוקלסטים בתרבית המכילים אנזים TRAP

אוסטאוקלסטים הם תאים גדולים, בצורת כיפה, מרובי גרעינים הנמצאים על פני העצם. תאים אלה מכילים גרגירים ציטופלזמיים רבים העשירים בחומצה עמידה לטרטרט, או TRAP - אנזים מטאלופרוטאין המופרש מהגבול המסולסל של האוסטיאוקלסטים לרקמת העצם. אנזים זה מעכל את המטריצה החוץ-תאית וממיס את גבישי המינרלים, מה שמקל על ספיגת העצם.

כדי לזהות גרגירי TRAP כסמנים ציטוכימיים של אוסטאוקלסטים, קח צלחת תרבית המכילה אוסטאוקלסטים דבקים. הוסף תמיסת צביעה TRAP לתאים. תמיסה זו כוללת את המצע - נגזרת נפתול המכילה פוספט וחומצה טרטרית במאגר בתוספת מלח דיאזוניום.

הוסף חומצה אצטית לתמיסה זו כדי לשמור על ה-pH החומצי הדרוש לצביעה של TRAP. דגרו את התאים בחושך בטמפרטורה פיזיולוגית לפעילות אנזימית TRAP אופטימלית.

תמיסת הצביעה נכנסת לאוסטאוקלסטים, שם החומצה הטרטרית מעכבת את פעילות ההידרוליזה של פוספטאזות חומצה רגישה לטרטרט בתאים אחרים.

במקביל, TRAP מבצע הידרוליזה של המצע הנוסף כדי להסיר את קבוצת הפוספט שלו. המצע שעבר הידרוליזה מתחבר עם מלח דיאזוניום מתמיסת הצביעה ליצירת קומפלקס צבע בלתי מסיס בצבע חום. קומפלקס זה משקע כגרגירים באתרי הפעילות האנזימטית.

דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ. התצהיר של גרגירי צבע חום בתוך הציטופלזמה מאשר את נוכחותם של אוסטאוקלסטים המכילים TRAP בתרבית.

בשלב זה, שאפו את המדיום, ושטפו את הדגימה בעדינות שלוש פעמים עם 1X PBS. לאחר מכן, תקן את התאים בכל באר של צלחת 96 הבארות עם 100 מיקרוליטר של תמיסת תיקון למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר הקיבוע יש לשאוב את תמיסת התיקון ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים במים דה-יונים, מחוממים מראש ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המים נטולי היונים, והוסיפו 100 מיקרוליטר של כתם TRAP לכל באר של צלחת 96 הבארות.

מניחים את הצלחת באינקובטור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ומגנים מפני אור. לאחר הצביעה, שאפו את כתם ה-TRAP ושטפו בעדינות שלוש פעמים במים נטולי יונים. לאחר מכן, צלמו את האוסטיאוקלסטים במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 40.