צביעה אדומה של אליזרין: טכניקה לדמיין מינרליזציה על ידי אוסטאובלסטים בתרבית

אוסטאובלסטים הם תאים יוצרי עצם המפרישים שלפוחיות קטנות לתוך המטריצה החוץ-תאית שלהם, ECM. שלפוחיות אלה, הנקראות שלפוחיות מטריצה, מצוידות במובילי ממברנה ואנזימים המאפשרים כניסת יוני סידן ופוספט, ויוצרים גבישים מינרליים בתוכם. כאשר גבישים מצטברים, הם פורצים את קרום השלפוחית ויוצרים גושים מינרליים ב-ECM, המרכיבים את צפיפות המינרלים בעצם.

כדי לדמיין מינרליזציה, התחל עם תאי אוסטאובלסטים על פיגום תואם ביולוגית במדיום גידול מתאים. האוסטאובלסטים מתחברים לפיגום ומשתמשים בגורמי גדילה מהמדיום כדי להפריש שלפוחיות מטריצה היוצרות לאחר מכן גושים מינרליים ב-ECM.

שאפו את מדיום התרבות ושטפו את התאים כדי להסיר עקבות מדיה. טפל בתאים בתמיסת פורמלין, הגורמת לקישור צולב של ECM, קיבוע ושימור מבנה הרקמה. שטפו את התאים כדי להסיר את כל הפורמלין שנותר.

לאחר מכן, הוסף תמיסת מכתים אדומה של אליזרין ודגר את התרבות. מולקולות הצבע נקשרות לגוש המינרלי ומתחברות לסידן, מינרל עצם מרכזי, ויוצרות קומפלקסים מוכתמים גדולים.

שאפו את תמיסת הצביעה ושטפו היטב כדי להסיר כל צבע לא כרוך. כאשר הם נצפים במיקרוסקופ, מרבצי המינרלים העשירים בסידן מופיעים כגושים אדומים בהירים ב-ECM, מה שמעיד על מינרליזציה על ידי האוסטאובלסטים.

מדיום תרבית שאיבה מאוסטאובלסטים ראשוניים, 14 יום לאחר הוספת מדיום מינרליזציה אוסטאוגני. שוטפים פעמיים עם 0.5 מיליליטר 1X PBS. לאחר מכן, תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת פורמלין חוצצת 10%, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, שאפו את הפורמלין המאגר 10% עם פיפטה חד פעמית, ושטפו פעמיים עם 0.5 מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת צביעה של 40 מילי-מולרית של Alizarin Red S לאוסטאובלסטים הקבועים, ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על שייקר ב-100 שייקים לדקה.

לאחר הדגירה עם תמיסת מכתים, שאפו את תמיסת הצביעה בעזרת פיפטה חד פעמית, ושטפו עם 1 מיליליטר מים טהורים במיוחד. חזור על שלב זה 5 עד 10 פעמים עד שתמיסת השטיפה תרד צלולה כדי להסיר כתמים לא ספציפיים. לאחר שאיבת הכביסה הסופית, הוסיפו 1 מיליליטר PBS קר, ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על שייקר כמו קודם. לאחר מכן, העבירו את דיסק הבטא-טריקלציום פוספט המוכתם לבאר חדשה, וסרקו את הלוחות עם סורק שטוח כדי לתעד מינרליזציה.