אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:42 דק׳ • July 8th, 2025
פרוטאוגליקנים מורכבים מחלבון ליבה המחובר קוולנטית לשרשראות גליקוזאמינוגליקן סולפטיות.
כדי לדמיין פרוטאוגליקנים, התחל עם פיגומים מבוססי קולגן - המצע הפולימרי הנקבובי - וזרע עליהם את תאי הגזע המזנכימליים, או MSC, תרחיף עליהם. זה מספק תמיכה מבנית ל-MSCs ומאפשר להם לגדול על פני השטח כמו גם בתוך חללי הפיגומים.
לטפל במבנים במדיום התמיינות כונדרוגני המכיל גורמי גדילה משתנים המניעים את הטרנספורמציה של MSCs לכונדרוציטים בוגרים - תאים סחוסיים. כונדרוציטים בוגרים מפרישים פרוטאוגליקנים היוצרים רשת עם הקולגן בפיגום.
קח קטע שהוכן מהמבנה עמוס הכונדרוציטים. הוסף תמיסה חומצית של כתם כחול אלציאני בתוספת גואנידיום הידרוכלוריד ודגירה. במהלך הדגירה, הגואנידין הידרוכלוריד בתמיסת הצבע מפרק כל אגרגטים פרוטאוגליקניים לצביעה טובה יותר.
לאחר מכן, הגליקוזאמינוגליקנים הסולפטיים הטעונים שלילית מהפרוטאוגליקנים נקשרים למולקולות הצבע הכחול האלציאני המכילות נחושת טעונות חיובית, וכתוצאה מכך משקעים כחולים.
לאחר מכן, טבלו את השקופית בתמיסה מעכבת המכילה מגנזיום כלוריד. יוני המגנזיום מתחרים עם מולקולות הצבע הטעונות חיובית על אתרי הקישור על הגליקוזאמינוגליקנים, ובכך מונעים צביעת יתר.
דמיינו את הקטע. צבע כחול מאשר את נוכחותם של פרוטאוגליקנים בדגימה
כדי לבצע התמיינות כונדרוגנית ממכשיר רפואי בצורת ספוג המורכב מקולגן ליופילי מסוג 1, חותכים קוביות 3 מילימטרים לכל צד. זרע MSCs על גבי הקוביות בריכוז של 4 x 106 תאים/מ"ל.
לאחר מתן אפשרות לתאים להיצמד לקוביות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, שמור על מבני MSC-קולגן בתווך כונדרוגני, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מוסיפים 0.4% תמיסה כחולה אלציאנית לחלקים, ודוגרים למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
למחרת, השתמש ב-40% DMSO ו-0.05 מגנזיום כלוריד מולארי כדי לשטוף את התאים במשך 30 דקות לפני השימוש באדום גרעיני מהיר כדי להכתים את התאים.