אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 2:59 דק׳ • July 8th, 2025
להפרדת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים של חלבון מעניין מליזאט חלבון חיידקי שעבר דיאליזה, הוסף מאגר מחייב כדי להפחית את צמיגות הליזאט ולמנוע ממנו לסתום את העמודה הכרומטוגרפית.
חומרי הקלאט במאגר קושרים קטיונים דו-ערכיים, מעכבים את פעילות הפרוטאז ומונעים פירוק חלבונים. בנוסף, המאגר עם pH מעל הנקודה האיזואלקטרית של חלבון המטרה, pI, ה-pH שבו לחלבון אין מטען נטו, גורם ליוני ההידרוקסיל הטעונים שלילית העודפים לנטרל את קבוצות האמינים הטעונות חיובית של החלבון, מה שהופך את פני החלבון לבעלי מטען שלילי.
הרכיבו את עמודת הכרומטוגרפיה של חילופי האניונים המכילה פאזה נייחת צולבת מבוססת אגרוז עם קבוצות אמינים רבעוניות טעונות חיובית. הוסף את מאגר הקישור כדי להכין את העמודה לאינטראקציה מקסימלית של חלבון במהלך טעינת הדגימה. טען את ליזט החיידקים המדולל.
חלבוני המטרה הטעונים שלילית נקשרים חזק יותר לקבוצות הטעונות חיובית בעמודה מאשר חלבונים בעלי מטען שלילי פחות.
הפעל את מאגר הקישור כדי להסיר חלבונים טעונים חיובית לא קשורים מהעמודה. העבירו מאגר פליטה דרך העמוד, והגדילו בהדרגה את ריכוז המלח. בריכוזי מלח נמוכים, יונים שליליים מתחרים עם חלבונים הקשורים חלש כדי להיקשר לעמודה, וגורמים לפליטתם.
לאחר מכן, מאגר ריכוז המלח הגבוה מחליף חלבונים קשורים היטב מעניינים עם זמן שמירה ארוך יותר, ומבטל את חלבוני המטרה. ניתן להש
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים