אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:22 דק׳ • July 8th, 2025
כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית תלויה בסידן היא טכניקה להפרדת חלבונים קושרי סידן מחלבונים אחרים שאינם קושרים סידן בדגימה.
כדי להתחיל, קח עמודת כרומטוגרפיה שהורכבה מראש המכילה מטריצה של חרוזי אגרוז צולבים שמקורם בקבוצות פניל הידרופוביות כדי להקל על אינטראקציות עם חלבוני המטרה. אזנו אותו עם מאגר מחייב המכיל ריכוז גבוה מאוד של יוני סידן לאינטראקציה מקסימלית של שרף וחלבון מטרה במהלך טעינת הדגימה שלאחר מכן.
קח דגימה המכילה את תערובת החלבון הדיאליזה והשלם אותה בריכוז שווה של סידן כלורי כפי שמשמש במאגר הקישור לאיזון עמודות. זה ממקסם את קשירת החלבון לעמודה.
יוני סידן נקשרים לחלבונים ספציפיים בליזאט, וגורמים לשינוי קונפורמציה במולקולות החלבון הללו וחושפים את האזורים ההידרופוביים שלהן.
מסננים את התערובת כדי להפריד זיהומים ואגרגטים כדי למנוע מהם לסתום את העמוד. טען את המסנן הזה לעמודה המאוזנת מראש. חלבונים עם אזורים הידרופוביים חשופים מקיימים אינטראקציה עם קבוצות הפניל ההידרופוביות המתאימות של השרף.
שטפו באמצעות מאגר הקישור המכיל מלח כדי להסיר חלבונים לא קשורים לשיפור טוהר הדגימה בשלבים מאוחרים יותר. העבירו את מאגר הפליטה ללא סידן כלוריד המכיל EDTA - כלאטור דו-ערכי - דרך העמודה.
כאשר EDTA מכלאת את יוני הסידן, האינטראקציות ההידרופוביות בין חלבון המטרה לשרף מופרעות. חלבוני המטרה הופכים ניידים ונפלטים מהעמודה.
להמשך טיהור החלבון, לאחר דיאליזה של חלבון, הוסיפו סידן כלורי לדגימה לריכוז סופי של 25 מילימולר, מה שיקל על קשירת S100A12 לשרף בשלב הבא. לאחר מכן, סנן את הדגימה דרך פילטר בגודל מזיגה של 0.45 מיקרון.
לאזן מאגרי HIC ודגימות ל-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חבר את מאגרי העמודות HIC-A ו- B ואת העמודה, למערכת והתאם את הפרמטרים.
התחל את השיטה כדי לאזן את העמודה עם 1 עד 2 נפחי עמודות של מאגר HIC-A, וטען את הדגימה, ואת 'בלוק הדגימה הלא מאוגד לשטוף' כאשר אות ה-UV מגיע שוב לרמת הבסיס.
לאחר מכן, התחל את הפליטה עם בופר EDTA המכיל סידן כלטור. אסוף 2 מיליליטר של שברי שיא במהלך הפליטה.