טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של ניקל: טכניקה לטיהור חלבונים רקומביננטיים מתויגים פוליהיסטידין מליזט תאי חיידקים

כדי לטהר חלבון רקומביננטי המאוחה לתג פולי-היסטידין - מחרוזת של שאריות היסטידין בקצה אחד - מליזאט תא חיידקי, ראשית, יש לדלל את ליזאט התא כדי למנוע סתימת עמודים במהלך ריצה כרומטוגרפית.

הרכיבו עמודת זיקה המכילה קטיוני ניקל דו-ערכיים המשותקים על מטריצת חרוז אגרוז באמצעות חומצה ניטרילוטריאצטית, חומר כלאט. חומצה ניטרילוטריאצטית קושרת קטיונים של ניקל באמצעות ארבעה אתרים קוולנטיים קואורדינטים, בעוד ששני אתרים על יון המתכת נשארים זמינים לאינטראקציות עם תגי פולי-היסטידין בחלבון המבוקש.

איזון העמודה עם מאגר מתאים כדי לייעל את התנאים לאינטראקציות מתכת-חלבון יעילות. טען את הליזאט של התא על העמודה.

חלבונים רקומביננטיים, הנושאים שאריות היסטידין סופיות נגישות, יוצרים קשרי תיאום עם קטיונים ניקל בשל הזיקה הגבוהה של יון המתכת לאימידזול, שרשרת הצד של היסטידין, ונקשרים למטריצה. המספר הגבוה של היסטידינים רצופים בחלבון הרקומביננטי מחזק את הקשר שלו למטריצה.

לשם השוואה, חלבונים חסרי שאריות היסטידין אינם נדבקים לעמוד ונפלטים בזרימה. שוטפים את העמוד עם מאגר אימידזול בריכוז נמוך.

אימידזול מתחרה עם מזהמי חלבון בעלי קשר חלש שאולי נדבקו באופן לא ספציפי למטריצה באמצעות שאריות היסטידין בשרשרת הפוליפפטיד שלהם, עקרו אותם והקלו על הפליטה. שטפו את העמודה עם מאגר אימידזול מרוכז מאוד כדי לנתק את החלבונים הרקומביננטיים ה