הטיהור Baculovirus מבוסס כרומטוגרפיה של הפרין: טכניקה לבידוד Baculovirus מ- Supernatant של תאי חרקים

0 צפיות3:40 דק' • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Baculoviruses - נגיפי DNA דו-גדיליים - מוקפים במעטפת המכילה גליקופרוטאינים נגיפיים עיקריים, כמו GP64.

כדי לבודד נגיפי בקולוניום מתרבית תאים המכילה פסולת תאית וחלבונים מזהמים, הרכיבו עמודת כרומטוגרפיה של זיקה להפרין המכילה מטריצה של חרוזי אגרוז צולבים. חרוזים אלה מחוברים להפרין, פוליסכריד ליניארי עם קבוצות סולפט, המעניקות מטען שלילי לשרשרת הפרין.

אזנו את העמודה עם מאגר כביסה בעל pH ניטרלי וחוזק יוני אופטימלי כדי לספק תנאים נוחים לאינטראקציות מקסימליות של נגיף הבקולו-וירוס והפרין במהלך העמסת העל. טען את הסופרנטנט המכיל נגיף הבקולו על העמוד.

חומצות האמינו הבסיסיות ב-Baculovirus GP64 מקלות על אינטראקציות אלקטרוסטטיות לא ספציפיות עם הפרין הטעון שלילי ונקשרות בחוזקה לעמוד, בניגוד למזהמים הנקשרים באופן רופף. שטפו את העמוד עם מאגר כביסה, והסירו חלבונים ופסולת מזהמים לא קשורים וקשורים באופן רופף.

העבירו מאגר פליטה בעל חוזק יוני גבוה יותר מאשר מאגר כביסה דרך העמודה. החוזק היוני הגבוה יותר משבש את האינטראקציות האלקטרוסטטיות של נגיף הבקולו-הפרין, ומנתק ומרחיק נגיפי בקולואה מהעמודה.

אסוף את ה-eluate המכיל baculovirus בזרימה. יש לדלל מיד את תרחיף נגיף הבקולו עם מאגר המכיל ריכוזי מלח פיזיולוגיים, ומונע את השבתת הנגיף. ניתן להשתמש בנגיפי הבקולו-וירוס המבודדים לניתוח נוסף.

הגדר את מערכת הכרומטוגרפיה על ידי הנחת קו חיץ הכביסה מיציאת הכניסה A1 לבקבוק המכיל לפחות 500 מיליליטר של מאגר כביסה. השתמש ביציאת כניסת המאגר A2 לטעינת מאגר הפליטה.

הכנס כמה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר לתוך אספן השברים כדי לאסוף את הסופרנטנט של נגיף הבקולו-וירוס העובר בעמודה, את מאגר הכביסה ואת נגיף הבקולו-וירוס המנומק. אזן את עמוד הפרין עם חמישה נפחי עמודות של 7.9 מיליליטר של מאגר כביסה, בקצב זרימה ליניארי של 7 מיליליטר לדקה.

טען 250 מיליליטר של סופרנטנט baculovirus על עמודת הפרין, באמצעות משאבת הדגימה של יציאת דגימת הכניסה בקצב זרימה ליניארי של 2 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, הפעל 10 נפחי עמודות של מאגר כביסה דרך עמודת הפרין בקצב זרימה ליניארי של 2 מיליליטר לדקה, עד שעקומת הספיגה האולטרה סגולה תחזור לקו הבסיס ותהפוך ליציבה.

לדלל את חלקיקי נגיף הבקולו מעמודת הפרין בחמישה נפחי עמודה של מאגר פליטה בקצב זרימה ליניארי של 4 מיליליטר לדקה. שימו לב לשיא פליטה חד של חלבון בכרומטוגרמה כאשר חלקיקי נגיף הבקולו מתנתקים מעמודת הפרין.

לאחר הפליטה, יש לדלל מיד את הסופרנטנט של נגיף הבקולו-וירוס פי 10 באמצעות מאגר נתרן פוספט של 20 מילי-מולרי כדי למנוע השבתה של חלקיקי נגיף הבקולו מהלם אוסמוטי במהלך הצנטריפוגה שלאחר מכן.

10:41

באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

סרטונים קשורים

0 צפיות

07:50

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

סרטונים קשורים

0 צפיות

10:31

פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וירוס הקשורים לאדנו (AAV)2 וקטור באמצעות מערכת תרבית תאים של חרקים בקלווירוס

סרטונים קשורים

0 צפיות

06:00

בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

סרטונים קשורים

0 צפיות

11:22

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:45

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

סרטונים קשורים

0 צפיות

06:11

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

סרטונים קשורים

0 צפיות

11:53

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

סרטונים קשורים

0 צפיות

08:12

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

סרטונים קשורים

0 צפיות

09:14

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

סרטונים קשורים

0 צפיות

עודכן לאחרונה: 1 אוגוסט 2026