הטיהור Baculovirus מבוסס כרומטוגרפיה של הפרין: טכניקה לבידוד Baculovirus מ- Supernatant של תאי חרקים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:40 דק׳ • July 8th, 2025
Baculoviruses - נגיפי DNA דו-גדיליים - מוקפים במעטפת המכילה גליקופרוטאינים נגיפיים עיקריים, כמו GP64.
כדי לבודד נגיפי בקולוניום מתרבית תאים המכילה פסולת תאית וחלבונים מזהמים, הרכיבו עמודת כרומטוגרפיה של זיקה להפרין המכילה מטריצה של חרוזי אגרוז צולבים. חרוזים אלה מחוברים להפרין, פוליסכריד ליניארי עם קבוצות סולפט, המעניקות מטען שלילי לשרשרת הפרין.
אזנו את העמודה עם מאגר כביסה בעל pH ניטרלי וחוזק יוני אופטימלי כדי לספק תנאים נוחים לאינטראקציות מקסימליות של נגיף הבקולו-וירוס והפרין במהלך העמסת העל. טען את הסופרנטנט המכיל נגיף הבקולו על העמוד.
חומצות האמינו הבסיסיות ב-Baculovirus GP64 מקלות על אינטראקציות אלקטרוסטטיות לא ספציפיות עם הפרין הטעון שלילי ונקשרות בחוזקה לעמוד, בניגוד למזהמים הנקשרים באופן רופף. שטפו את העמוד עם מאגר כביסה, והסירו חלבונים ופסולת מזהמים לא קשורים וקשורים באופן רופף.
העבירו מאגר פליטה בעל חוזק יוני גבוה יותר מאשר מאגר כביסה דרך העמודה. החוזק היוני הגבוה יותר משבש את האינטראקציות האלקטרוסטטיות של נגיף הבקולו-הפרין, ומנתק ומרחיק נגיפי בקולואה מהעמודה.
אסוף את ה-eluate המכיל baculovirus בזרימה. יש לדלל מיד את תרחיף נגיף הבקולו עם מאגר המכיל ריכוזי מלח פיזיולוגיים, ומונע את השבתת הנגיף. ניתן להשתמש בנגיפי הבקולו-וירוס המבודדים לניתוח נוסף.
הגדר את מערכת הכרומטוגרפי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים