כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:33 דק׳ • July 8th, 2025
כרומטוגרפיה של חילופי קטיון מקלה על הפרדת חלבון מתערובות על סמך מטען פני השטח הנקי שלהן.
לבידוד חלבון מתמר אותות מטרה מליזאט חלבון תאי חרקים, השג ליזאט חלבון מטרה בדיאליזה המכיל חלבונים מזהמים אחרים. הוסף בופר המכיל נתרן כלורי כדי להפחית את צמיגות הליזאט ולשפר את מסיסות החלבון, מה שמסייע במניעת סתימת עמודות כרומטוגרפיות במהלך הריצה.
בנוסף, pH חיץ מתחת לנקודה האיזואלקטרית של חלבון המטרה, pI, שבו לחלבון יש מטען נטו אפס, מקל על קשירה של יוני מימן עודפים לקבוצות קרבוקסילט שליליות, מה שהופך את חלבון המטרה לטעון חיובית.
הרכיבו את העמודה הכרומטוגרפית המכילה חרוזי אגרוז צולבים המחוברים לקבוצות טעונות שלילית. הוסף מאגר מחייב כדי לאזן את העמודה ולמקסם אינטראקציות בין עמודה לחלבון. טען את הליזט המדולל על העמודה המאוזנת.
חלבוני מטרה בעלי מטען חיובי יותר מקיימים אינטראקציה ונקשרים בחוזקה לקבוצות הטעונות שלילית של העמודה מאשר חלבונים מזהמים בעלי מטען חיובי פחות.
שטפו את העמוד עם חיץ כדי להסיר חלבונים מזהמים טעונים שלילית. לאחר מכן, העבירו את מאגר הפליטה, תוך הגדלת חוזקו היוני בהדרגה.
בחוזק יוני נמוך, קיימת תחרות מינימלית בין היונים החיוביים והחלבונים עבור הקבוצות השליליות בעמודה, הפולטות חלבונים מזהמים בעלי קשר חלש ופחות טעונים חיובית. עם זאת, ככל שהחוזק היוני גדל, יוני מלח מתחרים בחלבוני מתמר א
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים