בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אם תאים ונוזל ביולוגי מעניין משחררים או מכילים RNA המכיל אקסוזומים. הצעד הראשון לבידוד אקסוזומים הוא הסרת תאים ופסולת תאים. לאחר מכן, הסופרנאט מסוננת כדי להסיר חלקיקים גדולים יותר.

לאחר מכן האקסוזומים מועברים דרך אולטרה-צנטריפוגה כשלב שני. האקסוזומים מאופיינים במיקרוסקופ אלקטרונים, ציטומטריית זרימה וניתוח דם מערבי כדי להראות שלשלפוחיות המבודדות יש את גודל המורפולוגיה והרכב החלבון של אקסוזומים. ה-RNA הבא מבודד מהאקסוזומים המטוהרים.

על מנת לקבוע איזה RNA, האקסוזומים מכילים את התוצאות המתקבלות על ידי שיטות מבוססות אלה לטיהור, זיהוי ואפיון של אקסוזומים יכולים להקל על מחקרים נוספים של אקסוזומים כמו הפונקציות הביולוגיות שלהם. אז המצגת הזו תראה לכם כיצד ניתן לבודד אקסוזומים באמצעים שונים, ושני האנשים שיציגו זאת הם שני הדוקטורנטים שלי, מריה, אל וססיליה. בהצלחה.

קו תאי המסה האנושית, HC one משמש להדגמת בידוד אקסוזומים זו כדי להתחיל בהליך לבידוד אקסוזומים. ראשית, גדל תאים במדיום עם סרום חופשי אקסוזום. לאחר מכן העבירו את תרחיף התא לצינורות חרוטיים וצנטריפוגה ב -300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לגלול התאים מעבירים את שם העל לצינורות אולטרה צנטריפוגה ומצנטריפוגה את הדגימה ב-16, 500 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר עוד יותר תאים ופסולת תאים. לאחר מכן, סנן את ה-SANE דרך מסנן של 0.2 מיקרון כדי להסיר חלקיקים גדולים מ-200 ננומטר. לבסוף, צינורות האולטרה-צנטריפוגה המכילים את השפוי המסונן נאטמים אולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 פעמים G למשך 70 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את האקסוזומים.

האקסוזומים נשלפים על ידי חיתוך צינור האולטרה-צנטריפוגה, השלכת הסנאט והחייאת הכדור המועשר באקסוזום. לאחזור אקסוזום מקסימלי. Resus משהה את הכדור המועשר באקסוזום שוב ושוב בנפח קטן של מאגר מתאים לתוך צינור orph eend.

יש לשטוף פעמיים עם חוצץ נוסף באותו נפח כמו הקודם. המאגר תלוי בסוג הניסויים העוקבים אחר האקסוזום. בידוד. למיקרוסקופ אלקטרונים השתמש בכ-10 מיקרוגרם של חלבון אקסו-סומלי מהאקסוזומים השלמים.

הושעה ב-PBS הופיע. ניתן לבצע את מיקרוסקופ האלקטרונים של רשת הניקל המצופה פחמן שלנו ללא צביעה חיסונית מכיוון שניתן לזהות אקסוזומים אך ורק על סמך מורפולוגיה של גודל. עם זאת, מומלץ להשתמש בנוגדנים ראשוניים כגון אנטי CD 63 או אנטי MHC Class 2, ואחריו נוגדנים משניים מסומנים זהב 10 ננומטר.

מכיוון שהאקסוזומים קטנים מכדי להיות מזוהים על ידי ציוד ציטומטריית זרימת זרם, יש צורך לקשור תחילה את האקסוזומים לחרוזים מצופים נוגדנים. בהתאם למקור התאי האקסו-סומלי, נוגדנים שונים מחוברים לחרוזים מגנטיים או לטקס. בהדגמה זו, חרוזי הלטקס המצופים נגד CD 63 ישמשו לכל דגימה.

השתמש בנפח השווה ל-30 עד 40 מיקרוגרם של חלבון אקסו-סומלי של האקסוזום השלם. תלויים ב-PBS דוגרים אקסוזומים בחרוזים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתנועה עדינה. למחרת נחסם על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של 200 מילי-מולרי גליצין ודגירה למשך 30 דקות.

שטפו את קומפלקס החרוזים האקסוזומי פעמיים וחצץ הכביסה דגרו את מתחמי החרוזים האקסוזומיים עם נוגדן IgG של 50 מיקרוליטר בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את מתחמי החרוזים האקסוזומיים פעמיים, הוסיפו 90 מיקרוליטר, מאגר כביסה ונוגדנים של 10 מיקרוליטר לבחירה למתחמי חרוזי האקסום ודגרו במשך 40 דקות בחושך. בתנועה עדינה, שטפו את מתחמי חרוזי האקסום פעמיים, הוסיפו מאגר כביסה של 300 מיקרוליטר והעבירו את הדגימות לצינורות ציטומטריית זרימה ורכשו נתונים באמצעות ציטומטריית זרימה.

הדגמת הכתם המערבי תתמקד בחשיבות של בידוד חלבון מתאים לפני הכתם המערבי והנוגדנים השונים בהם נעשה שימוש. ממיסים את כדור האקסוזום בנשיפה של ליזיס החלבון לבחירתכם ופיפטה ביסודיות ואחריה ערבוב מערבולת כדי לחזק את האקסוזומים, סוניקציה של הדגימה בצנטריפוגה של אמבט מים את הדגימה 13,000 פעמים G למשך חמש דקות והעבירו את ה-SANE לצינור איינור חדש. מדוד את סך החלבון בשיטה לבחירתך והעמיס את החלבון על הג'ל.

לאחר מכן יש להפריד ולהעביר את החלבונים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ובלוק אלקטרו בלוטינג ולשטוף את הממברנה לפני ביצוע צביעה חיסונית כנגד חלבונים מועשרים באקסוזומים מכיוון שאין סמנים ספציפיים לאקסוזומים. חלבונים המועשרים באקסוזומים מכל המקורות התאיים השונים משמשים בדרך כלל לזיהוי אקסוזומים. מדובר בחלבונים כמו טטרספנינים, למשל, CD 9, CD 63 ו-CD 81.

חלבונים הקשורים לשלד הציטו כגון אזרין וחלבונים המעורבים בביוגנזה רב-שלפוחית כגון TSG 1 0 1 ו-LY כבדיקת בקרה שלילית לחלבונים מזהמים הנמצאים בדרך כלל בשלפוחיות מתאים אחרים כגון קקסין ו-GRP 78 מהרטיקולום האנדופלזמי. ניתן להשתמש בערכות בידוד RNA שונות בהתאם לניסויים המתוכננים. בהדגמה זו, ייעשה שימוש בשיטה מבוססת-עמודות בעת ביצוע בידוד RNA.

חשוב להשתמש בקצות פיפטות נטולות חומצות גרעין ונוקלאז ולנגב גם את הספסל וגם את הציוד נקיים ממזהמים ו-RNA. ממיסים את גלולת האקסוזום ב-350 מיקרוליטר של תמיסת ליזה ומערבלים את הדגימה. מוסיפים 200 מיקרוליטר אתנול 95% ומערבבים בעזרת מערבולת.

הניחו עמוד בצינור איסוף והעבירו את האקסוזומים הליזים לעמוד ולצנטריפוגה שטפו שלוש פעמים ב -400 מיקרוליטר תמיסת כביסה כדי לוודא שהעמוד יבש. צנטריפוגה למשך שתי דקות ב-14,000 פעמים G לאחר הכביסה האחרונה והנח את העמוד היבש בצינור RPH חופשי של RNA. ה-RNA במאגר אלוסיאני של 50 מיקרוליטר לזיהוי וניתוח של סך האקסו סומל שחולץ, RNA.

ניתן להשתמש בביו-אנלייזר Agilent 2100 עם ערכת RNA 6, 000 ננו או RNA 6, 000 פיקו מכיוון שהאקסוזומים קטנים מכדי שניתן יהיה לזהות אותם בשיטות ציטומטריית זרימה זמינות. הם מחוברים לחרוזים מצופים נוגדנים לפני שהם מנותחים. מכיוון שמתחמי חרוזים אקסוזומיים אלה יכולים לצבור ציטומטריית זרימה, תרשים פיזור יכול להכיל אוכלוסיות שונות של קומפלקסים חרוזי אקסוזום כפולים ומשולשים.

כפי שמוצג כאן, החץ מציין את האוכלוסייה של קומפלקסים בודדים של חרוזי אקסוזום, שהיא האוכלוסייה שנותחה עוד יותר. היסטוגרמה של ציטומטריית זרימה מראה אוכלוסיית חרוזי אקסוזום בודדת חיובית לחלבון CD 63. ככל שהעקומה הפתוחה רחוקה יותר ימינה, כך המדגם חיובי יותר עבור CD 63.

בשל גודלם הקטן של האקסוזומים, ניתן לדמיין אותם רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. מאפיינים מורפולוגיים אופייניים של אקסוזומים כוללים שלפוחיות עגולות בגודל 30 עד 100 ננומטר. כתם חיסוני אקסוזומי עם נוגדן ליברלי זהב ל-CD 63 מוצג מסומן על ידי כתם החץ המערבי.

התוצאות מראות את היעדר חלבון הרטיקולום האנדופלזמי קלנקסין בדגימת האקסו-אומל, אך מראות את נוכחות הטטרספאן ב-CD 81, שהוא חלבון המועשר בדרך כלל באקסוזומים. RNA תאי מכיל בעיקר RNA ריבוזומלי, הנראה כשתי הפסגות עבור תת-יחידת ה-RNA הריבוזומלית של 18 s הנראית משמאל ותת-היחידה של 28 s הנראית מימין בניתוח ביו-אנלייזר זה. עם זאת, RNA אקסו סומלי נבדלים זה מזה בפרופילים שלהם מכיוון שהם מכילים מעט או ללא RNA ריבוזומלי ומועשרים בקיצור, RNA כגון שליח, RNA ומיקרו RNA לאחר שליטה.

ניתן לבצע את הבידוד תוך כשלוש שעות אם נעשה כהלכה. בזמן השימוש בשיטה זו, חשוב לבצע את כל השלבים, כולל אי תיוק כדי למנוע זיהום של ICs גדולים יותר. לאחר פיתוח טכניקה זו, נעשה הרבה יותר קל לאפיין אקסוזומים, הן מבחינה ביוכימית והן מבחינה ביולוגית.

יתר על כן, למדנו הרבה יותר על התקשורת בין תא לתא בתיווך אקסוזום במערכות שונות. כמו כן, הטכניקה אפשרה לפתח אקסוזומים כסמנים ביולוגיים למחלות שונות. תודה רבה על תשומת הלב.