Name: בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: למדו שיטות לבידוד ואפיון אקסוזומים המכילים RNA מתרביות תאים ונוזלים ביולוגיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ומיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלו מאפשרות ניתוח תכולה מולקולרית לחקר תפקודים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המועצה למחקר השוודי (K2008-57X-20 676-01-3).

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JL היא הבעלים במשותף של פטנט הקשור לניצול exosomes כמו וקטורים להעברת RNA לתאים.

כאשר לומדים את תוכן מולקולרית ו / או פונקציה של exosomes, חשוב להשתמש באיכות גבוהה בידוד שיטה המספק תשואה המתאים את מידת הנמוך ביותר האפשרי של זיהום. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה היא גישה מבוססת היטב לבידוד exosomes וללמוד תוכן RNA שלהם פונקציה ביולוגית. יתר על כן, החשיבות של אפיון של exosomes מבודד, על ידי שילוב של שיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה, ואת כתם המערבי, הוא הדגיש. כאשר בידוד exosomes, צנטריפוגה בשלב הראשון (300 XG) משמש גלולה תאים שעלולים להיות נוכח ההשעיה תא או נוזל ביולוגי למד. צנטריפוגה השני 16 500 XG צריך להיות חזק מספיק כדי גלולה תאים מתים, פסולת גדולים, גופים אפופטוטיים, אברונים אחרים. לאחר צנטריפוגה זה, פרוטוקולים מסוימים כוללים צעד ננו סינון, אבל כמה Investigators יש נשלל על שלב זה. עם זאת, אנו מדגישים את החשיבות של שברי בביעור ועל שלפוחית ​​גדול יותר מאשר 200 ננומטר, ולכן ממליצים כולל בשלב הסינון. אם בידוד מחמירים יותר יש צורך מסננים 100 ננומטר ניתן להשתמש, אבל שים לב כי אם נוזלי צמיג משמשים, מסננים אלה יכולים בקלות להיות חסום חומר exosomal אבוד. כמו כן, סינון 100 ננומטר עשוי להשפיע על המורפולוגיה של exosomes יתר על כן, אם exosomes הם בקנה מידה גדול יותר הם עלולים ללכת לאיבוד. לפיכך, 200 ננומטר מסננים נראה מתאים בידוד exosome. לאחר סינון, ultracentrifugation המנדט ב XG 120,000 משמש גלולה exosomes. Exosomes ניתן לכבס נוסף עם PBS, חייב חרוזים מצופים נוגדן ורחץ, או דגש על צבע סוכרוז להסיר חלבונים זיהום. עם זאת, זה יכול להיות תהליך מאוד משאב רב אנו טוענים כי לא יהיה צורך בכך, במיוחד אם היקף המדגם המוצא היא קטנה ו / או תוכן o-RNAf exosomes הוא נמוך, כמו צעדים נוספים באופן משמעותי להקטין את חומר נוסף. עם זאת, שוב, אופיו של שלפוחית ​​מבודד צריך להיות מוכח על ידי נוכחות והיעדרות של חלבונים מסוימים. עד כה, סמן לא חלבון ייחודי לחלוטין exosomes זוהתה כדי לוודא כי המדגם מכיל exosomes ולא שום דבר אחר. כתוצאה מכך, שילוב של שיטות נדרשים לאפיין את exosomes, כולל קביעת גודל ומורפולוגיה של exosomes על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים. כמו כן, טוהר המדגם ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כמו שיטה זו יכולה לספק סקירה של רמת הזיהום של המדגם, למשל עם שלפוחיות גדולות יותר, כגון microparticles, גופים אפופטוטיים או פסולת התא. יתר על כן, התוכן של חלבון exosomes ניתן לקבוע על ידי cytometry זרימה כתם המערבי, ואת השילוב של שני אלה התוצאות שיטות ניתוח של הממברנה הן קשורות (למשל, CD63 וCD81) ו הפנימו חלבונים (למשל Tsg101 ואליקס) של exosomes. זיהוי של חלבונים מועשר exosomes, כגון CD63, Tsg101 ואליקס, והעדר של חלבונים, כגון חלבון endoplasmic reticulum calnexin, אינדיקציה כי exosome מועשר גלולה אכן exosomes ולא שלפוחית ​​לזהם מתוך תאים אחרים של התא. הפרופיל של RNA כי הוא זוהה exosomes הוא שונה במהותו לזה של RNA נמצא בתאים שלמים. לפיכך, RNA exosomal ונותחו על ידי Bioanalyzer או ג&#39;ל מבוססי RNA גישות ניתוח חוסר שתי פסגות של 18S rRNA ו -28 יחידות משנה, אשר הבולטים בניתוח של רנ&quot;א הסלולר. לפיכך, אנו טוענים כי גילוי של כל כמויות משמעותיות של rRNA במדגם מצביעה על כך RNA הכולל חילוץ הוא לא מוצא exosomal לבד, ולכן כי שיטת הבידוד צריך להיות שיפור איכות מובטחת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Exosome בידוד </td></tr><tr><td> אופטימה L-90k ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר חותם ultracentrifuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> בהתאם הרוטור צינורות שונים המשמשים נדרשים. Ti70 (342,414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Tube חותם Cordless טופר ערכת </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur מזרק מסנן 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> עבור נוזלים ויסקוזה ו / או בכמויות גדולות, מערכת סינון אבק, 0.2 מיקרומטר, מן VWR הבינלאומי יכול לשמש במקום (514-0600). </td></tr><tr><td> במיקרוסקופ אלקטרונים </td></tr><tr><td> Formvar / פחמן מצופה ניקל רשתות </td><td> טד פלה Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556019 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> השליטה אלוטיפ; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-IgG עכבר זהב המצומד, 10 ננומטר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 1% </td></tr><tr><td> ליאו 912AB אומגה מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> תזרים cytometry </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / סולפט לטקס חרוזים </td><td> Interfacial Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן לציפוי של חרוזים לטקס </td><td></td><td></td><td> לדוגמה אנטי CD63 מ BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> האינטליגנטי מיקסר RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> IgG בסרום של אדם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים לאיתור </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> לדוגמה: PE אנטי CD63 (556,020) PE אנטי CD9 (555,372) PE אנטי CD81 (555,676) שליטה אלוטיפ (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כתם המערבי </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> Elma </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> בידוד של RNA ו-RNA exosomal ניתוח </td></tr><tr><td> miRCURY RNA בידוד Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של rna המכיל exosomes

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

תחום המחקר exosome הוא המתרחב במהירות, עם גידול דרמטי הפרסומים בשנים האחרונות. בועיות אלו קטנות (3-10 ננומטר) ממוצא endocytic הוצעו הראשון לתפקד כדרך reticulocytes למגר את הקולטן transferrin תוך התבגרות לתוך אריתרוציטים 1, נקראו מאוחר יותר exosomes. Exosomes נוצרות על ידי ניצני פנימה של המנוח endosomes, ייצור גופי multivesicular (MVBs), והן מתפזרות בסביבה על ידי איחוי של MVBs עם קרום הפלזמה 2. מאז הגילוי הראשון של exosomes, מגוון רחב של תאים הוכחו לשחרר אלה שלפוחיות. Exosomes יש גם זוהה נוזלים ביולוגיים, ובהם רוק פלזמה, האף נוזל שטיפה ו חלב 3-6. יתר על כן, הוכח כי התוכן והתפקוד של exosomes תלוי בתא שמקורם ואת התנאים שבהם הם מיוצרים. מגוון פונקציות כבר שדיםtrated עבור exosomes, כגון אינדוקציה של סובלנות נגד 7,8 אלרגן, מיגור של גידולים הוקמה בשנת 9 עכברים, עיכוב והפעלה של תאים הרוצח הטבעי 10-12, קידום התמיינות לתאי T רגולטוריים 13, גירוי של התפשטות תאים T ו - 14 אינדוקציה של תא T אפופטוזיס 15. שנת 2007 הראינו כי exosomes שוחרר מתאי הפיטום מכילים RNA שליח (mRNA) ו microRNA (מירנה), וכי RNA יכול להיות דילג מתא אחד למשנהו באמצעות exosomes. בתוך התאים הנמען, mRNA דילג על ידי exosomes הוצגה להיות מתורגם לחלבון, דבר המצביע על תפקיד הרגולציה של ה-RNA להעביר 16. יתר על כן, אנו הראו גם כי exosomes מתאי צמח תחת סטרס חמצוני יכול לגרום ללחץ נוסף סובלנות נגד בתאים הנמען ובכך להציע הפונקציה הביולוגית של המעבורת exosomal RNA 17. תרבית תאים מדיה ביולוגית שיתוף נוזליםntain תערובת של שלפוחית ​​ולשפוך שברים. באיכות גבוהה בידוד שיטה exosomes, ואחריו אפיון וזיהוי של exosomes ואת התוכן שלהם, לכן חיוני להבחין בין שלפוחית ​​exosomes וחלקיקים אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה הבידוד של exosomes ממדיום שני תאים תרבות נוזלי הגוף. שיטה זו מבוססת על בידוד צנטריפוגה חוזרות צעדים סינון, ואחריו צעד ultracentrifugation הסופית שבה exosomes הם pelleted. שיטות חשוב לזהות את exosomes ולאפיין את המורפולוגיה exosomal ואת תכולת החלבון מודגשים, לרבות במיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה כתם המערבי. טיהור של RNA exosomal הכולל מבוסס על כרומטוגרפיה בעמודה ספין התשואה exosomal RNA והפצה גודל מנותח באמצעות Bioanalyzer.

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

תחום המחקר של האקסוזומים מתרחב במהירות, עם עלייה דרמטית במספר הפרסומים בשנים האחרונות. שלפוניות קטנות אלו (30-100 ננומטר) של...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע האם תאים ונוזלים ביולוגיים רלוונטיים משחררים או מכילים אקסוזומים המכילים RNA. השלב הראשון לבידוד אקסוזומים הוא הסרת תאים ושאריות תאים. לאחר מכן, מסננים את העלייה (supernatant) כדי להסיר חלקיקים גדולים יותר.בשלב שני, האקסוזומים משוקעים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. האקסוזומים מאופיינים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית, ציטומטריה של זרימה ואנליזה של western blot כדי להראות כי לוהסיקים המבודדים בעלי המורפולוגיה, הגודל וההרכב החלבוני של אקסוזומים. לאחר מכן, RNA מבודד מהאקסוזומים המזוקקים.על מנת לקבוע אילו RNA מכילים האקסוזומים, התוצאות המתקבלות באמצעות שיטות מבוססות אלו לטיהור, לזיהוי ולאפיון של אקסוזומים יכולות להקל על מחקרים נוספים של אקסוזומים, כגון תפקודיהם הביולוגיים. לכן, מצגת זו תראה לכם כיצד ניתן לבודד אקסוזומים באמצעים שונים, ושני האנשים שיציגו זאת הם שני דוקטורנטים שלי, מריה וססיליה. בהצלחה.קו התאים של תאי מעטפת (mast cells) אנושיים, HC-1, משמש להדגמה זו של בידוד אקסוזומים כדי להתחיל בתהליך הבידוד. ראשית, גדלו את התאים במדיום עם סרום נטול אקסוזומים. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לשפופרות קוניות וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.כדי לשקע את התאים, העבירו את הנוזל העליון למבחנות אולטרה-צנטריפוגה וסובבו את הדגימה ב-16,500 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להסיר תאים ושיירי תאים נוספים. לאחר מכן, סננו את הנוזל העליון דרך מסנן של 0.2 מיקרון כדי להסיר חלקיקים הגדולים מ-200 ננומטר. לבסוף, את מבחנות האולטרה-צנטריפוגה המכילות את הנוזל המסונן סובבו באולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 ×g למשך 70 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקע את האקסוזומים.האקסוזומים מאוחזרים על ידי חיתוך ופתיחה של מבחנת העיקרון-צנטריפוגה, השלכה של הנוזל העליון (supernatant) וריסוסน์ (resuspend) של הכדורית העשירה באקסוזומים. לקבלת מקסימום אקסוזומים, יש לבצע ריסוסน์ חוזר של הכדורית העשירה באקסוזומים בנפח קטן של באפר מתאים לתוך מבחנה מסוג Eppendorf.שטפו פעמיים עם בופר נוסף בנפח זהה לקודמו. סוג הבופר תלוי בסוג הניסויים שיבוצעו לאחר בידוד האקסוזומים. עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית, השתמשו בכ-10 micrograms של חלבון אקסוזומלי מהאקסוזומים השלמים.בוצעה השהייה מחדש ב-PBS. ניתן לבצע מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות רשת ניקל מצופה פחמן ללא צביעה אימונוגנית, שכן ניתן לזהות אקסוזומים על בסיס המורפולוגיה והגודל בלבד. עם זאת, מומלץ להשתמש בנוגדן ראשוני כגון anti CD 63 או anti MHC Class two, ולאחריו נוגדים שניוניים המסומנים בזהב בגודל 10 nanometer.מכיוון ש portfolios-אקסוזומים קטנים מכדי להיות מזוהים על ידי ציוד פלוו-ציטומטריה נוכחי, יש צורך לקשור תחילה את האקסוזומים לחרוזים מצופים בנוגדנים. בהתאם למקור התאי של האקסוזום, נוגדנים שונים מצומדים לחרוזי מגנט או לטקס. בהדגמה זו, ייעשה שימוש בחרוזי לטקס מצופים ב-anti CD 63 עבור כל דגימה.השתמשו בנפח השקול ל-30 עד 40 micrograms של חלבון אקסוזומלי מהאקסוזום השלם. לאחר השהיה ב-PBS, דגרו את האקסוזומים עם חרוזי הג'ל למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס תחת תנועה עדינה. למחרת, בצעו חסימה על ידי הוספת 300 microliters של 200 millimolar glycine ודגרו למשך 30 דקות.שטפו את קומפלקס חרוזי האקסוזומים פעמיים עם תמיסת שטיפה, ולאחר מכן דגרו את קומפלקסי חרוזי האקסוזומים עם 50 µL של נוגדן IgG בטמפרטורה של 4 °C. שטפו את קומפלקסי חרוזי האקסוזומים פעמיים, הוסיפו לקומפלקסים 90 µL תמיסת שטיפה ו-10 µL מהנוגדן הנבחר, ודגרו למשך 40 דקות בחושך. תחת תנועה עדינה, שטפו את קומפלקסי חרוזי האקסוזומים פעמיים, הוסיפו 300 µL תמיסת שטיפה, העבירו את הדגימות לאنبובות ציטומטריה זרימה (flow cytometry) ורכשו נתונים באמצעות ציטומטריה זרימה.הדגמה זו של Western blot תתמקד בחשיבותה של בידוד חלבונים מתאים לפני ה-Western blot ובנוגדנים השונים המשמשים לכך. המיס את משקע האקסוזומים בתמיסת ליזיס לחלבונים לפי הבחירה, בצע פיפטור thorough followed by vortex mixing כדי ללייז את האקסוזומים הלאה, בצע סוניקציה לדגימה באמבט מים, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,000 ×g למשך חמש דקות והעבר את המעמקים (supernatant) לפרובט איפנדור חדשה. מדוד את סך החלבון בשיטה נבחרת והעמס את החלבון על הג'ל.לאחר מכן, הפרה והעבירו את החלבונים באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ובלוטינג חשמלי, ושטפו את הממברנה לפני ביצוע צביעה אימונולוגית נגד חלבונים המועשרים באקסוזומים, מכיוון שאין סממנים ספציפיים לאקסוזומים. חלבונים המועשרים באקסוזומים ממקורים תאיים שונים משמשים בדרך כלל לזיהוי אקסוזומים. אלו הם חלבונים כגון tetraspanins, לדוגמה, CD9, CD63 ו-CD81.חלבונים הקשורים לשלד התא כגון ezrin וחלבונים המעורבים בביוגנזה של וסיקולות רב-וסיקוליות כגון TSG 1 0 1 ו-LY, כאשר כביקורת שלילית נבדקו חלבונים מזיהמים הנמצאים בדרך כלל בוסיקולות מתאים אחרים, כגון kexin ו-GRP 78 מהרשת האנדופלזמית. ניתן להשתמש בערכות בידוד RNA שונות בהתאם לניסויים המתוכננים. בהדגמה זו, נעשה שימוש בשיטה מבוססת עמודה לביצוע בידוד ה-RNA.חשוב להשתמש בקצות פיפטה נקיים מחומצות גרעיניות ומנוקליאזות, ולניגוב של השולחן והציוד כדי להסיר מזהמים ו-RNAs. המיסו את משקע האקסוזומים ב-350 µL של תמיסת ליזיס ובצעו וורטקס לדגימה. הוסיפו 200 µL של 95% ethanol וערבבו באמצעות וורטקס.מקמו עמודה בתוך מבחנת איסוף, העבירו את האקסוזומים שנותחו לעמודה וסבבו במערכת צנטריפוגה. שטפו שלוש פעמים ב-400 µL של תמיסת שטיפה כדי להבטיח שהעמודה יבשה. סבבו במערכת צנטריפוגה למשך שתי דקות ב-14,000 ×g לאחר השטיפה האחרונה, והניחו את העמודה היבשה במבחנת RNase-free. בצעו אלואציה ל-RNA ב-50 µL של באפר אלואציה לצורך זיהוי וניתוח של ה-RNA האקסוזומלי הכולל שהופק.ניתן להשתמש ב-Agilent 2100 bioanalyzer עם ערכת RNA 6,000 nano או RNA 6,000 pico, מכיוון שאיקסוזומים קטנים מדי מכדי שניתן יהיה לזהותם בשיטות זרימה ציטומטריות (flow cytometry) זמינות. הם מחוברים לחרוזיים מצופים בנוגדנים לפני שהם מנותחים. מכיוון שקומפלקסים של חרוזי איקסוזומים אלו עלולים להתרקם, תרשים פיזור של זרימה ציטומטרית עשוי להכיל אוכלוסיות שונות של קומפלקסים בודדים, כפולים או משולשים של חרוזי איקסוזומים.כפי שמוצג כאן, החץ מצביע על אוכלוסיית קומפלקסים של חרוזים עם אקסוזום בודד, שהיא האוכלוסייה המנותחת בהמשך. היסטוגרמה של ציטומטריה זרימה מראה אוכלוסיית חרוזי אקסוזום בודדת חיובית לחלבון CD 63. ככל שהעקומה הפתוחה נמצאת יותר ימינה, כך הדגימה חיובית יותר ל-CD 63.בשל גודלם הקטן של אקסוזומים, ניתן להדגים אותם רק באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. מאפיינים מורפולוגיים טיפוסיים של אקסוזומים כוללים שלפוחיות עגולות בגודל של 30 עד 100 ננומטר. צביעה אימונוהיסטוכימית של אקסוזום עם נוגדן CD63 המסומן בזהב מוצגת בחץ ב-Western blot.התוצאות מראות היעדרות של חלבון הרשת האנדופלזמית calnexin בדגימת האקסוזומים, אך מראות נוכחות של הטטרספנין CD 81, وهو חלבון המועשר בדרך כלל באקסוזומים. RNA תאי מכיל בעיקר RNA ריבוזומלי, הנראה כשני שיאים עבור תת-היחידה 18 s של ה-RNA הריבוזומלי הנראים משמאל ותת-היחידה 28 s הנראים מימין בניתוח ביו-אנלייזר זה. לעומת זאת, פרופילי ה-RNA של האקסוזומים שונים, שכן הם מכילים מעט או ללא RNA ריבוזומלי ומואשרים ב-RNA קצר, כגון mRNA ו-microRNA.ניתן לבצע את הבידוד תוך כשלוש שעות אם הפעולה מבוצעת נכון. בעת שימוש בשיטה זו, חשוב לבצע את כל השלבים, כולל השלבים שאינם כוללים סינון, כדי למנוע זיהום של וסיקולות גדולות יותר. לאחר פיתוח טכניקה זו, הפך אפיון של אקסוזומים, הן מבחינה ביוכימית והן מבחינה ביולוגית, לפשוט בהרבה.יתרה מכך, למדנו הרבה יותר על התקשורת בין תאים המתווכת על ידי אקסוזומים במערכות שונות. כמו כן, הטכניקה אפשרה לפתח אקסוזומים כסמנים ביולוגיים למחלות שונות. תודה רבה על תשומת לבכם.

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

מתוארות טכניקות המתארות הליך שיפוע להפרדת אקסוזומים מחלקיקי נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). הליך זה שימש לבידוד אקסוזומים הרחק מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאנשים נגועים ב-HIV. האקסוזומים המבודדים נותחו לתכולת ציטוקין/כימוקין.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

נוזל המרה הוא מקור יקר לשלפוחיות חוץ-תאיות/אקסוזומים המכילים סמנים ביולוגיים בעלי פוטנציאל חשוב. פרוטוקול זה מייצג שיטה חזקה לבידוד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל miRNA.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Exosome הוא דור חדש של ספקיות שירות משלוח סמים. הקמנו פרוטוקול בידוד exosome עם תשואה גבוהה וטוהר למסירה siRNA. אנו גם אנקפסולציה siRNA שאינם ספציפיים שכותרתה fluorescently לתוך exosomes, חקר את ספיגת הסלולר של siRNA טעונים exosomes בתאים סרטניים.

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים שמקורם בטחול עכברים באמצעות שילוב של עיכול עם קולגן מסוג I ואולטרה-צנטריפוגה.

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

למדו שיטות לבידוד ואפיון אקסוזומים המכילים RNA מתרביות תאים ונוזלים ביולוגיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ומיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלו מאפשרות ניתוח תכולה מולקולרית לחקר תפקודים ביולוגיים.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

גלה סרטונים נוספים