כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך: שיטה חזקה לכימות של חומצות סיאליות עם תווית פלואורסצנטית ופירוק שבודדו מכבד עכבר

חומצות סיאליות, כגון חומצה N-אצטילנויראמנית וחומצה N-גליקולילנויראמינית, הן חלקיקי פחמימות טעונים שלילית הנמצאים בקצוות הדיסטליים של שרשראות אוליגוסכריד על פני תאי יונקים.

כדי לכמת כמויות יחסיות של חומצות סיאליות אלו ברקמת כבד עכבר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך או RP-HPLC, ראשית, יש לטפל בתערובת החומצה הסיאלית המבודדת עם חומר נגזרת. סוכן הנגזרת מקיים אינטראקציה עם הקבוצות הפונקציונליות של חומצות סיאליות, ויוצר נגזרות יציבות של חומצה סיאלית פלואורסצנטית.

הרכיבו עמוד RP-HPLC, המחובר לגלאי פלואורסצנטי. העמודה מורכבת משלב נייח נקבובי מבוסס סיליקה הקשור לליגנדים של שרשרת אלקיל לא קוטביים, הידרופוביים כדי להקל על אינטראקציות סלקטיביות עם נגזרות חומצה סיאלית במהלך ריצה כרומטוגרפית.

איזון העמודה באמצעות פאזה ניידת קוטבית מימית המכילה ריכוזים נמוכים של אצטוניטריל, ממס אורגני פחות קוטבי, למיזוג אופטימלי של העמודה.

טען את תערובת החומצה הסיאלית הנגזרת לעמודה.

חומצה N-אצטילנוראמינית, המכילה קבוצת N-אצטיל הידרופובית, סופחת חזק יותר לליגנדים ההידרופוביים של השלב הנייח מאשר חומצה N-גליקולילנויראמנית עם קבוצת N-גליקוליל הידרופילית.

ניתוח הדגימות, באמצעות מערכת HPLC סטנדרטית המחוברת לגלאי פלואורסצנטי מקוון. השתמש בעמודת C-18 הפוכה באורך של 250 מילימטר וקוטר של 4.6 מילימטר לצורך הניתוח.

לאחר הכנת ממס A וממס B, והגדרת הפעלת HPLC כמפורט בפרוטוקול הטקסט, הזרקו 50 מיקרוליטר מהדגימה למערכת HPLC.

ניטור נוזלים, באמצעות אורך גל עירור גלאי פלואורסצנטי של 373 ננומטר, ואורך גל פליטה של 448 ננומטר.

לבסוף, חשב את הכמות היחסית של Neu5Gc כמתואר בפרוטוקול הטקסט.