אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:05 דק׳ • July 8th, 2025
חלבוני ממברנה אינטגרליים חיידקיים, המעוגנים לממברנות דו-שכבתיות של שומנים, מקלים על הובלת מולקולות על פני ממברנות והעברת אותות. עבור מחקרים מבניים, חלבונים רקומביננטיים אינטגרליים ספציפיים מתבטאים יתר על המידה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק התמזג, GFP.
כדי להעריך את יציבות חלבון הממברנה הרקומביננטית לאחר המסת חומר ניקוי, השג שבר ממברנה חיידקית המכיל חלבוני ממברנה אינטגרליים מתויגים GFP. הוסף חומר ניקוי לא יוני. מעבר לריכוז הקריטי, חומר הניקוי יוצר מיצלות.
מיצלות מקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים וחלבוני ממברנה, מסיסות את הממברנות ויוצרות קומפלקסים של חלבון-דטרגנטים. בנוסף, האזורים הטרנסממברניים ההידרופוביים של חלבוני הממברנה עשויים להישאר ללא מסכה, ולגרום לצבירת חלבונים. יתר על כן, GFPs חופשיים עלולים להיגרם עקב פירוק חלבוני הממברנה.
צנטריפוגה את התערובת. אסוף את הסופרנטנט המכיל חומר ניקוי מסיס בחומר ניקוי.
הרכיבו עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל המחוברת לגלאי פלואורסצנטי. מטריצת העמודות מורכבת מחרוזי אגרוז עם גדלי נקבוביות המגדירים טווח פיצול רחב.
איזון העמודה עם מאגר המכיל חומר ניקוי כדי למזער אינטראקציות לא ספציפיות ולשמור על מסיסות חלבון.
טען את שבר הממברנה המסיס לתוך העמודה. אגרגטים של חלבונים מתחמקים מהנקבוביות הגדולות ביותר ונעים דרך החללים הבין-חלקיקיים בין החרוזים, ונפלטים
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים