כרומטוגרפיה של זיהוי פלואורסצנטיות של אי הכללת גודל: טכניקה לזיהוי שלמות חלבוני הממברנה הפלואורסצנטית בעת מסיסות חומרי ניקוי

חלבוני ממברנה אינטגרליים חיידקיים, המעוגנים לממברנות דו-שכבתיות של שומנים, מקלים על הובלת מולקולות על פני ממברנות והעברת אותות. עבור מחקרים מבניים, חלבונים רקומביננטיים אינטגרליים ספציפיים מתבטאים יתר על המידה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק התמזג, GFP.

כדי להעריך את יציבות חלבון הממברנה הרקומביננטית לאחר המסת חומר ניקוי, השג שבר ממברנה חיידקית המכיל חלבוני ממברנה אינטגרליים מתויגים GFP. הוסף חומר ניקוי לא יוני. מעבר לריכוז הקריטי, חומר הניקוי יוצר מיצלות.

מיצלות מקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים וחלבוני ממברנה, מסיסות את הממברנות ויוצרות קומפלקסים של חלבון-דטרגנטים. בנוסף, האזורים הטרנסממברניים ההידרופוביים של חלבוני הממברנה עשויים להישאר ללא מסכה, ולגרום לצבירת חלבונים. יתר על כן, GFPs חופשיים עלולים להיגרם עקב פירוק חלבוני הממברנה.

צנטריפוגה את התערובת. אסוף את הסופרנטנט המכיל חומר ניקוי מסיס בחומר ניקוי.

הרכיבו עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל המחוברת לגלאי פלואורסצנטי. מטריצת העמודות מורכבת מחרוזי אגרוז עם גדלי נקבוביות המגדירים טווח פיצול רחב.

איזון העמודה עם מאגר המכיל חומר ניקוי כדי למזער אינטראקציות לא ספציפיות ולשמור על מסיסות חלבון.

טען את שבר הממברנה המסיס לתוך העמודה. אגרגטים של חלבונים מתחמקים מהנקבוביות הגדולות ביותר ונעים דרך החללים הבין-חלקיקיים בין החרוזים, ונפלטים ראשונים. קומפלקסים קטנים יותר של חומרי ניקוי חלבון נכנסים לכמה נקבוביות בחרוזים, חוצים נתיב ארוך יותר, ונעלמים מאוחר יותר. GFPs בחינם נכנסים לכל נקבוביות החרוזים ונעלמים אחרונים. גלאי הקרינה מנתח את השברים הנפלטים, ומזהה פלואורסצנטיות הנפלטת מ-GFP.

שיאי פלואורסצנציה סימטריים של קומפלקסים של חלבון-דטרגנט עם אגרגטים מינימליים ו-GFP חופשי מצביעים על התאמת חומר הניקוי למסיסות חלבון הממברנה.

עבור כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל שזוהתה על ידי פלואורסצנטיות או ניתוח FSEC, לאחר מכן, אזנו עמודת אי הכללת גודל עם טווח פיצול רחב עם מאגר זרימה רץ בקצב של 0.3 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, הזריק 100 מיקרוליטר של דגימת ממברנה מסיסה על העמודה באותו קצב זרימה, ופקח על פרופיל האשליה באמצעות אופטיקה פלואורסצנטית.