כרומטוגרפיית זיקה מבוססת DFE: טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים 2F5 מדגימה גולמית באמצעות תנאי אלוציה מבוססי חוזק יוני גבוה
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:41 דק׳ • July 8th, 2025
DFE או DsRed-2F5-Epitope הוא חלבון היתוך רקומביננטי המורכב מ-DsRed, חלבון פלואורסצנטי, ואת האפיטופ 2F5 - מקטע של אנטיגן גליקופרוטאין מעטפת HIV-1. לאפיטופ זה יש זיקה גבוהה לפרטופ שלו - אזור באזור הקובע את ההשלמה על הנוגדן החד-שבטי 2F5.
כדי לטהר נוגדנים חד-שבטיים 2F5 מדגימה גולמית, קח עמודה עמוסה בחרוזי שרף נקבוביים המכילים ליגנדים בעלי זיקה DFE משותקים על פני השטח שלהם. שטפו את העמוד עם מאגר שיווי משקל מתאים כדי לשמור על ה-pH ולמנוע אינטראקציות לא ספציפיות בין רכיבי הדגימה לשרף בשלבים הבאים.
טען את הדגימה המכילה את הנוגדנים החד-שבטיים 2F5 לתוך העמודה. בהדרגה, הנוגדנים בדגימה מתחילים לזרום דרך העמודה או השלב הנייח.
במהלך הזרימה, הנוגדנים מקיימים אינטראקציה הפיכה עם ליגנדות הזיקה של DFE המשותקות בשלב הנייח. באינטראקציות אלה, הפרטופ על נוגדן 2F5 נקשר במיוחד לאפיטופ המשלים שלו בליגנד DFE.
שטוף את העמודה עם מאגר שיווי משקל כדי להסיר דגימה לא רצויה הקשורה באופן לא ספציפי לעמודה. העבירו מאגר פליטה דרך העמודה.
החוזק היוני הגבוה של המאגר מערער את האינטראקציות בין ליגנדות DFE לנוגדנים חד-שבטיים 2F5. כתוצאה מכך, הנוגדנים החד-שבטיים נפלטים כשברים מהעמודה.
אסוף את שברי הנוגדנים המטוהרים, ואחסן אותם ליישומים במורד הזרם.
ראשית, הכינו 100 מיליליטר של תמצית הצמח המובהרת המכילה 2F5 או הסופרנטנט ממערכ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים