אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד: טכניקה אנליטית לזיהוי הפראן סולפטים באורכי שרשרת משתנים שבודדו מרקמת הריאה של עכבר

גליקוזאמינוגליקנים סולפטיים כמו הפראן סולפטים, HSs, הם פוליסכרידים טעונים שלילית, ליניאריים, סולפטיים באורכי שרשרת משתנים, המחוברים לחלבוני פני התא.

כדי להעריך HSs באורך שונה שבודדו מרקמת ריאות עכבר, התחל בהרכבת קלטת ג'ל. מלאו אותו חלקית בתמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד מרוכזת מאוד, כולל חומרים מזרזים - אמוניום פרסולפט וטטרה-מתיל-אתילן-דיאמין. כיסוי במים למניעת מגע אוויר, מה שעלול לעכב פילמור. דגירה.

חומרים מזרזים גורמים לפילמור אקרילאמיד-ביסקרילאמיד, ויוצרים ג'ל לפירוק נקבוביות קטנות. השליכו מים. הוסף ריכוז נמוך של תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד עם חומרים מזרזים. הכנס מסרק ג'ל ליצירת בארות. התמיסה מתפלמרת ויוצרת ג'ל ערימה בעל נקבוביות גדולות.

טען את תאי מיכל האלקטרופורזה במאגר פועל למוליכות חשמלית אופטימלית במהלך אלקטרופורזה.

ממיסים את תערובת ה-HS במאגר טעינה המכיל צבע מעקב וסוכרוז. לאחר מכן, העבירו את התערובת הזו וסולמות HS סטנדרטיים לבארות קלטות. סוכרוז מגביל את התערובת לבארות. צבע עוזר לעקוב אחר התקדמות האלקטרופורזה.

התחל אלקטרופורזה במתח נמוך. HSs טעונים שלילית חוצים את ג'ל הערימה, נעים לעבר האנודה הטעונה חיובית, ומתרכזים בממשק הג'ל הערום-פותר עקב הבדל בגודל הנקבוביות.

הגדל את המתח. HSs בעלי שרשרת קטנה נודדים במהירות דרך הג'ל המפתר, חוצים רחוק יותר, בעוד HSs ארוכי שרשרת נלכדים בתוך מטריצת הג'ל ונעים לאט.

לאחר אלקטרופורזה, יש להכתים את הג'ל. HSs מופיעים כרצועות נפרדות, כאשר HSs בעלי שרשרת קטנה ממוקמים נמוך יותר מ-HSs ארוכי שרשרת. ניתן לקבוע את אורך ה-HSs הבודדים על ידי השוואה לתקני HS.

התחל בהנחת קלטת ריקה לתוך מיכל ה-PAGE. יצוק את הג'ל המפרסק על ידי ערבוב של 10 מיליליטר של תמיסת ג'ל ממיס עם 60 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט טרי שהוכן בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של TEMED. הפוך את הצינור בעדינות 2 עד 3 פעמים.

הוסף במהירות 10 מיליליטר מתמיסת הג'ל הפוליאקרילאמיד המופעלת לקלטת באמצעות פיפטה. כיסוי עם 2 מיליליטר מים מסוננים דה-יונים, ואפשר לג'ל הממיס להתפלמר למשך 30 דקות.

לאחר שג'ל הפתרון התפלמר במלואו, השליכו את המים המכוסים. יצוק את ג'ל הערימה על ידי ערבוב של 3 מיליליטר של תמיסת ג'ל ערימה עם 90 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט טרי שהוכן בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 3 מיקרוליטר של TEMED, והפוך את הצינור בעדינות 2 עד 3 פעמים.

השתמש בפיפטה כדי להוסיף במהירות את תמיסת ג'ל הערימה מעל ג'ל הממיס המוצק, עד שהקסטה מתמלאת עד אפס מקום. הכנס במלואו את המסרק המצורף לקסטת הג'ל הריקה מפוליאקרילאמיד, ואפשר לג'ל הערימה להתפלמר למשך 30 דקות. לאחר שהג'ל התפלמר, הסר את רצועת הסרט מתחתית הקלטת, והנח את הקסטה בחזרה למכלול מיכל ה-PAGE. מלאו את התאים העליונים והתחתונים בתמיסות החיץ המתאימות.

ממיסים דגימות גליקוזאמינוגליקן מיובשות בנפח המינימלי ההכרחי של מים מסוננים נטולי יונים, ומערבבים עם מאגר טעינת דגימה ביחס של 1 ל-1. טען את הדגימות ואת סולמות האוליגוסכריד HS לתוך הג'ל.

הפעל מחדש את הג'ל למשך 5 דקות ב 100 וולט. לאחר מכן, הפעל אותו ב-200 וולט למשך 20 עד 100 דקות, תלוי באחוז האקרילאמיד של תמיסת הג'ל הפתרון.