אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:10 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בטיפול בדגימת החלבון עם מאגר דנטורינג המורכב מחומר ניקוי - נתרן דודציל סולפט, SDS, וחומר הפחתה - בטא-מרקפטואתנול. מחממים אותו לזמן קצר. במהלך שלב זה, בטא-מרקפטואתנול משבש את קשרי הדיסולפיד, ויוצר קונפורמציה פרושה לחלבון.
החלבונים שנפרשו עם חומצות האמינו ההידרופוביות החשופות שלהם נקשרים ל-SDS הטעון שלילי ורוכשים מטען שלילי אחיד. הוסף צבע מעקב מתאים לדגימה להדמיה בזמן אמת.
כעת, טען את הדגימה ואת סמן הגודל המולקולרי הסטנדרטי בבארות נפרדות הקיימות בג'ל הערימה - השכבה העליונה של ג'ל הפוליאקרילאמיד המכילה ריכוז נמוך יותר של פולימרים אקרילאמידים צולבים.
חבר את מנגנון הג'ל המלא במאגר לאספקת החשמל.
בנוכחות שדה חשמלי, חלבונים טעונים שלילית נודדים בחופשיות לכיוון האנודה ונערמים יחד כדי להיכנס לג'ל הפתרון - השכבה התחתונה המכילה ג'ל בריכוז גבוה יותר.
בג'ל הממיס, חלבונים מתחילים לנדוד בהתאם לגודלם המולקולרי, כאשר חלבונים קטנים יותר נודדים במהירות, וכתוצאה מכך רצועות חלבון שנפתרו בצורה אופטימלית. לאחר מכן, עצור את הריצה והסר את הג'ל.
צבעו את הג'ל בצבע אניוני, כחול Coomassie, שנקשר אלקטרוסטטית לחומצות האמינו הבסיסיות בחלבונים, ומעניק להן צבע כחול. לאחר מכן, יש להסיר את הג'ל בתמיסת חומצה אצטית להדמיה טובה יותר.
הסר את הג'ל וזהה את החלבונים המופרדים על סמך המשקל המולקולרי המשוער שלהם.
הכן שני ג'לים מפרידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. יוצקים את הג'ל בין לוחות הזכוכית בעזרת פיפטה של 1 מיליליטר, ומוודאים ששני הסנטימטרים העליונים נקיים מהתערובת. הוסיפו 70% אתנול על גבי הג'ל המפריד, וצרו ממשק אחיד בין שתי השכבות.
לאחר שהג'לים המפרידים התפלמרו, הכינו את ג'לי הערימה באמצעות הוראות בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, הסר את האתנול מהג'לים המפרידים, והוסף את תמיסת הג'ל הערימה. הכניסו בזהירות מסרק עם מספר הכיסים הרצוי, מבלי להכניס בועות אוויר, והניחו לג'ל להתפלמר במשך 20 עד 30 דקות.
טען 4 מיקרוליטר מכל דגימה, כמו גם את סולם החלבון, לבארות נפרדות. לאחר מכן, הפעל את הג'ל במאגר ריצה Tris-Glycine ב-144 וולט למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בתמיסת פיירבנקס A מחוממת מראש כדי להכתים את הג'לים על נדנדה למשך 30 דקות, ובתמיסת פיירבנקס D מחוממת מראש כדי להסיר את צבע הג'לים על נדנדה עד להשגת הרקע הרצוי.