דנטורינג אוריאה פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח RNA: טכניקה להפרדת אוליגונוקלאוטידים של RNA עם תווית פלואורסצנטית מהמקבילות הלא זרחניות שלהם

כדי להתחיל, קח דגימה המכילה אוליגונוקלאוטידים של RNA זרחניים ולא זרחניים המסומנים באופן פלואורסצנטי מעורבבים עם צבע הטעינה המכיל אוריאה. מחממים את הדגימה.

אוריאה - דנטורנט חזק - בשילוב עם החום מנטרל את מבנה ה- RNA המשני, וכתוצאה מכך הקונפורמציה הליניארית והלא מובנית שלו. כעת, יצוק את הג'ל על ידי ערבוב תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד עם אוריאה.

הוסף טטרמתילן דיאמין, זרז, ואמוניום פרסולפט, חומר מחמצן, כדי להקל על פילמור הג'ל שלאחר מכן.

שופכים את התמיסה למנגנון קלטת שהורכב מראש. הכנס מסרק, וצור בארות לטעינת דגימה. אפשר לג'ל להתפלמר. הנח את הקסטה במנגנון הג'ל. הוסף חיץ רץ למאגרים העליונים והתחתונים, תוך שמירה על זרימת הזרם דרך הג'ל כולו. הסר את המסרק.

טען את הדגימה המעורבבת בצבע הדמיה לבאר וחבר את הג'ל לאספקת חשמל במתח הרצוי. האוריאה בג'ל מאפשרת למולקולות RNA לנדוד כמינים ליניאריים.

הג'ל פועל כמסננת, ומאפשר למולקולות ה-RNA הטעונות שלילית לנוע דרך הנקבוביות לעבר האלקטרודה החיובית. במהלך הריצה, ה-RNA הזרחני שלילי יותר מטבעו נע מהר יותר מ-RNA שאינו זרחני.

דמיין את הג'ל לזיהוי RNA עם תווית פלואורסצנטית. שימו לב לשינוי הניידות בין ה-RNA הזרחני הנודד מהר יותר, המופיע כרצועה נמוכה יותר בהשוואה ל-RNA הלא זרחני.

להכנת תמיסת ג'ל אקרילאמיד 15%, שלבו 22.5 מיליליטר של תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד מעורבבת מראש 40% 29:1, 6 מיליליטר של 10X TBE, 28.8 גרם אוריאה ומים ללא RNase לנפח כולל של 59 מיליליטר. לאחר מכן, מערבבים בעדינות את התמיסה.

מחממים את התמיסה במיקרוגל למשך 20 שניות, מערבבים אותה ומחזירים אותה מיד למיקרוגל למשך 20 שניות נוספות. מערבבים בעדינות את התמיסה עד להמסה מלאה של האוריאה. הנח את הזכוכית באמבט מים רדודים, המכיל מים קרים, למשך 5 דקות, וודא שרמת המים הקרים המקיפים את הזכוכית גבוהה מרמת התמיסה בתוך הזכוכית. כאשר התמיסה קרירה, סנן והסיר אותה עם יחידת סינון חד פעמית של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים ובועות אוויר מיקרוסקופיות.

שוטפים צלחת זכוכית קצרה וארוכה במים וסבון. לאחר מכן, רססו כל צלחת באתנול 95%, ונגבו את הכוס כדי להסיר לחות. הרם את הצלחת הארוכה ממשטח הספסל על ידי הנחתה על גבי קופסה. לאחר מכן, מקם מרווחים של 0.4 מילימטר לאורך הקצוות הארוכים של הצלחת. הנח את הצלחת הקצרה על גבי הצלחת הארוכה, וודא ששולי הצלחת הקצרה, הצלחת הארוכה והמרווחים מיושרים. לאחר מכן, מהדקים כל צד עם שלושה מהדקי מתכת במרווחים שווים.

הוסף 24 מיקרוליטר TEMED לתמיסת האקרילאמיד וערבב אותו. לאחר מכן, הוסיפו 600 מיקרוליטר של 10% APS, ושפכו מיד את התמיסה בין לוחות הזכוכית.

מזיגת תמיסת האקרילאמיד בין כריך צלחת הזכוכית יכולה להיות ממש מאתגרת. כדי למנוע בועות אוויר, הקש על כריך צלחת הזכוכית בזמן שאתה מוזג את התמיסה שלך.

בזהירות, הוסיפו מסרק נקי של 32 בארות לחלק העליון של כריך צלחת הזכוכית, והניחו לאקרילאמיד להתפלמר למשך 30 דקות.

כדי להפעיל את הג'ל, הגדר את גוש החום ל 75 מעלות צלזיוס, הסר את המתכת clamps ושטוף וייבש היטב את כריך צלחת הזכוכית. מקם את כריך הצלחת במנגנון הג'ל כשהצלחת הקצרה פונה קדימה, והכן מאגר ריצה של 0.5X TBE על ידי שילוב של 100 מיליליטר של 10X TBE עם 1.9 ליטר מים ללא RNase.

הוסף 600 מיליליטר של המאגר הפועל לתאים העליונים והתחתונים של המנגנון. הסר בעדינות את המסרק מהג'ל ושטוף היטב את הבארות בעזרת מזרק. הפעל מראש את הג'ל ב -50 וואט למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את הבארות.

סובב את הדופק את התגובות המרוות, ודגר אותן בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. חזור על סיבוב הדופק, וטען מיד 10 מיקרוליטר מכל דגימה על הג'ל. לאחר מכן, הפעל את הג'ל למשך 3 שעות ב -50 וואט. בסיום הריצה, כבה את אספקת החשמל ורוקן את החדר העליון של המכשיר.

שוטפים ומייבשים את הצד החיצוני של כריך צלחת הזכוכית. לאחר מכן, כסו אותו בנייר כסף והעבירו אותו לסורק לייזר להדמיה. הרכיבו את כריך לוחית הזכוכית על ה-tagשל סורק הלייזר, הגדירו את אורכי גל העירור והפליטה עבור הפלואורופור הרצוי, ודמו את הג'ל.