אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

סיבי עמילואיד הם אגרגטים של חלבונים לא מקופלים, המציגים הטרוגניות בגודל. ניתן לנתח סיבים אלה, בהיותם עמידים בפני חומרי ניקוי אניוניים כגון SDS, באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז דו-ממדי.

כדי להתחיל, קח ג'ל אגרוז גדול בגודל נקבוביות שהורכב מראש המכיל SDS. הנקבוביות הגבוהה מאפשרת הפרדה של סיבים שלמים במהלך הריצה. שכבו את הג'ל עם מאגר פועל המכיל SDS.

טען ליזט תאים המכיל סיבי עמילואיד לתוך הג'ל. הנוכחות של SDS והיעדר שלב חימום הדגימה יוצרים תנאי דנטורציה למחצה שבהם חומר הניקוי נקשר לעמילואידים עמידים במיוחד ומעניקים מטען שלילי אחיד לסיבים השלמים.

הפעל את הג'ל במימד הראשון במתח המתאים. השדה החשמלי גורם לנדידה של עמילואידים טעונים שלילית לעבר האנודה הטעונה חיובית.

במהלך הריצה, סיבים קטנים יותר נודדים במהירות בהשוואה לגדולים יותר - ויוצרים דפוס פס דמוי מריחה המעיד על הטרוגניות בגודל.

בסיום, סובב את הג'ל בניצב והפעל אותו במימד השני. בממד זה, סיבים נעים באופן זהה לריצה הראשונה ונפרדים על סמך גודלם. זה יוצר מריחה אלכסונית מכיוון שסיבים קטנים יותר נודדים מהר יותר מהגדולים יותר.

היווצרות הרצועה האלכסונית החדה מאשרת אוכלוסיית עמילואיד סיבית שלמה אך הטרוגנית.

להכנת הג'ל מוסיפים 2 גרם אבקת אגרוז ל -200 מיליליטר מאגר TAE בכוס זכוכית. לאחר מכן, מחממים את הכוס במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז.

לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של 20% SDS לריכוז סופי של 0.1%. סובב בעדינות את הכוס.

לאחר מכן, שפכו את האגרוז הנוזלי על לוח ג'ל בגודל 15 ס"מ על 14 ס"מ. כדי להסיר בועות אוויר, השתמש בפיפטה של 1 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו מסרק של 20 באר על גבי הג'ל.

לאחר מכן, הוסף כ-60 מיקרוגרם של ליזאט תא שלם בנתיב הימני הקיצוני של הג'ל. הפעל את הג'ל ב-60 וולט למשך כארבע שעות, תוך שימוש במאגר TAE המכיל 0.1% SDS, כמאגר הפועל.

כדי להפעיל את הג'ל במימד השני, סובב בזהירות את הג'ל ב-90 מעלות נגד כיוון השעון. לאחר מכן, הפעל את הכלא ב-60 וולט למשך כארבע שעות.