JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:10 דק' • July 8th, 2025
כדי לנתח את חמשת הקומפלקסים המיטוכונדריאלים של שרשרת הנשימה עם יחידות משנה שלמות, השג קומפלקסים מיטוכונדריאלים מסיסים בחומר ניקוי עדין ולא יוני. יש לערבב עם חוצץ המכיל Coomassie Blue-G, צבע אניוני.
קומאסי מחליף את חומר הניקוי ונקשר באופן לא ספציפי למתחמים, מעניק מטען שלילי ומכתים אותם בכחול. בנוסף, Coomassie מונע את הצטברות הקומפלקסים ומסייע בשימור המבנה והתפקוד המקוריים שלהם.
במיכל אלקטרופורזה, הרכיבו קלטת ג'ל הכוללת ג'ל לפתרון שיפוע עם גודל נקבוביות הולך ופוחת לאורכו, ומעליו ג'ל ערימה גדול בגודל נקבוביות. מלאו את תאי האנודה והקתודה באנודה צוננת ובמאגר קתודה המכיל קומאסי.
טען את הבארות בתערובת קומפלקס חלבון קשור של Coomassie. התחל אלקטרופורזה.
קומפלקסי החלבון הטעונים שלילית נודדים מג'ל הערימה לג'ל מפרק השיפוע, לעבר האנודה הטעונה חיובית. בעוד קומפלקסים קטנים יותר עוברים במהירות דרך הנקבוביות, קומפלקסים גדולים יותר מואטים על ידי גדלי נקבוביות מגבילים כשהם נעים במורד הג'ל הפירוק.
Coomassie המנותק מהקומפלקסים במהלך הריצה מוחלף על ידי Coomassie במאגר קתודה, ומונע מהקומפלקסים לזוז ממיקומם בג'ל. לאחר אלקטרופורזה, דמיין את הג'ל. הקומפלקסים המיטוכונדריאלים מופיעים כרצועות כחולות שנפתרו בהתאם לגודל.
קומפלקס II עם המשקל המולקולרי הנמוך ביותר תופס את המיקום הנמוך ביותר בג'ל, ואחריו קומפלקס IV, III ו-V. קומפלקס I עם המשקל המולקולרי הגבוה ביותר תופס את המיקום הגבוה ביותר.
כדי לבצע את אלקטרופורזה הג'ל המקורית הכחולה, ראשית, הוסף את מאגר הקתודה הכחול לקלטת הג'ל. השתמש בפיפטה כדי לשטוף ולמלא את הבארות במאגר הקתודה הכחול. לאחר מכן, טען 5 עד 30 מיקרוגרם של דגימות חלבון לבארות. מלאו בעדינות את קלטת הג'ל למעלה עם מאגר הקתודה הכחול, ואת המיכל עם מאגר האנודה.
ראשית, הפעל את הג'ל במתח קבוע של 40 וולט למשך 15 דקות. לאחר מכן, הגדל את המתח ל 80 וולט. הפעל את הג'ל עד שהצבע יגיע ל-2/3 מאורך הג'ל. החלף את מאגר הקתודה הכחול במאגר הקתודה, והמשך באלקטרופורזה עד שחזית הצבע נגמרת מהג'ל.