אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:59 דק׳ • July 8th, 2025
קומפלקסים של חלבונים מולטימריים חיוניים לתהליכים ביולוגיים שונים.
כדי להפריד קומפלקסים של חלבונים במצבם המקורי על ידי multimer-PAGE, קח ליזאט רקמות המכיל את הקומפלקסים הרצויים. טען את הליזאט על מכלול ג'ל עבור Blue native PAGE.
מלאו את המערכת במאגר רץ אלקליין המכיל צבע אניוני כחול וחברו אותו לאספקת החשמל. ב-pH אלקליין, מולקולות צבע נקשרות לקומפלקס החלבון ומעניקות לו מטען שלילי כולל ללא דנטורציה. קומפלקס חלבון שלם וטעון שלילית זה נודד דרך הג'ל כפס כחול.
לאחר ריצה מינימלית, ומתן אפשרות לחלבון השלם לנדוד לתוך הג'ל הממיס, יש להוציא את הרצועה המכילה את הקומפלקס. דגרו את הרצועה בתמיסה המכילה חומר צולב כדי לאפשר לקבוצות התגובתיות שלה לקיים אינטראקציה עם קבוצות האמינים של החלבון הפרוקסימלי, ולייצב את הקומפלקס המולטימרי.
החלף את תמיסת הקישור הצולב במגיב מרווה כדי להרגיע את פעילות המקשרים הצולבים שלא הגיבו. הוסף SDS - חומר ניקוי אניוני - המעניק מטען שלילי אחיד לקומפלקס החלבון השלם תוך שמירה על גודלם המקורי והרכבם.
הניחו את הרצועה המטופלת בקסטה טרייה ויצקו אותה מחדש לג'ל SDS-PAGE חדש. במהלך אלקטרופורזה, קומפלקס החלבון הצולב הטעון שלילית נודד לעבר האנודה החיובית ומופיע כפס בעל משקל מולקולרי גבוה בג'ל.
כדי להתחיל בהליך זה, התכוננו לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי כחול, כמתואר בפרוטוקול הט
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים