אלקטרופורזה נימית: טכניקה לניתוח אמפליקונים של תגובת שרשרת פולימראז המסומנים באופן פלואורסצנטי

כדי לקבוע את גודל שברי ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה נימית, התחל בלקיחת לוחית בדיקה מרובת בארות. כל באר מכילה אמפליקונים PCR בעלי תווית פלואורסצנטית בגודל שונה - אוליגונוקלאוטידים דו-גדיליים של DNA המתקבלים לאחר מחזור PCR.

הוסף לבאר כמה מקטעי DNA דו-גדיליים בגודל שונה, המשמשים כתקן גודל. כל אחת ממולקולות ה-DNA הללו נושאת תג פלואורסצנטי לזיהוי קל.

משלימים את הבאר עם פורממיד, דנטורנט חזק, ומחממים בטמפרטורה גבוהה. שלב זה מנטרל את ה-DNA, ויוצר שברים חד-גדיליים שיכולים לנדוד בקלות דרך נקבוביות הג'ל.

הנח את הצלחת ביחידת מנתח שברים המכילה ג'ל פולימרי מוזרק מראש בתוך מערכת הנימים שלה.

הפעל מתח גבוה כדי להכניס באופן אלקטרוקינטי את ה- DNA מהבאר לנימים בקוטר דק בקתודה - הקצה השלילי. מולקולות ה-DNA הטעונות שלילית נודדות לעבר האנודה הטעונה חיובית. גדילי ה-DNA הקצרים יותר מתמודדים עם פחות כוח חיכוך ונעים מהר יותר דרך הג'ל מאשר גדילי ה-DNA הארוכים יותר.

במהלך הגירה חשמלית, הדנ"א חוצה את נתיב קרן הלייזר, מה שגורם לצבע להאיר. אותות הפליטה מהצבע נלכדים על ידי גלאי ומתורגמים מאוחר יותר לאלקטרופרוגרמה - גרף המייצג כל DNA פלואורסצנטי כשיא אינדיבידואלי בצבע שונה.

השווה את שיא שבר ה-DNA הלא ידוע עם פסגות הייחוס כדי לנתח את גודלו.

לאחר אישור מגברי PCR, השתמש ברצועות או לוחות PCR חדשים, כדי לדלל מוצרי PCR 1 עד 10 במים מטוהרים. מערבולת וצנטריפוגה בקצרה. תוך כדי עבודה בארון אדים, הכינו תערובת מאסטר בצינור צנטריפוגה המורכב מפורממיד ותמיסה סטנדרטית בגודל ייחוס.

בהתאם למספר תוצרי ה-PCR שיש לנתח, השתמש בנפחי ריאגנטים, כמפורט בכתב היד. אפשר נפח עודף של 10%.

מערבולת קצרה והפצה של 9.5 מיקרוליטר לבארות בודדות על צלחת PCR, המתאימה למערכת האלקטרופורזה הנימים הזמינה. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של מוצר PCR מדולל. חותמים וצנטריפוגה בקצרה.

לאחר מכן, טען את הצלחת המכילה את הדגימות לתוך מחזור תרמי PCR, ודטרטור את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, לפני קירור ל-4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. צנטריפוגה ב -1,000 x גרם למשך דקה. הסר בזהירות את החותם והעמיס את הצלחת על מערכת אלקטרופורזה נימית מכוילת בהתאם להוראות היצרן.

הפעל ניתוח שברים אלקטרופורזה נימית באמצעות ריאגנטים בהתאם למנגנון הנבחר, והתאם את תנאי הריצה בהתאם לתיאור בכתב היד.