אלקטרופורזה ג'ל אלקליין חד-תאי: טכניקה רגישה להערכה כמותית של נזק לדנ"א בתאי סרטן בודדים לאחר כימותרפיה

תרופות כימותרפיות גורמות לשבירת DNA חד-גדילית וכפולה בתאים סרטניים, וגורמות לנזק ל-DNA ולמוות של תאים.

כדי לכמת את הנזק ל-DNA, ערבבו את תאי הסרטן שטופלו בכימותרפיה עם אגרוז מותך נמס נמוך. שפכו את התערובת הזו על שקופיות זכוכית מצופות מראש של אגרוז. אפשר לאגרוז המותך להתמצק, להטמיע את התאים בתוך מטריצת הג'ל הנקבובית.

טפל במאגר ליזה המכיל ריכוזים גבוהים של חומרי ניקוי ומלחים. חומרי ניקוי מסיסים ממברנות תאיות וגרעיניות. יתר על כן, מלח גבוה מסיר את חלבוני ההיסטון מה-DNA, ומשאיר DNA מפותל מחובר למטריצה הגרעינית.

דגירה במאגר אלקטרופורזה אלקליין. הסביבה האלקליין גורמת לסלילי העל של ה-DNA להירגע, וחושפת שברי DNA חד-גדיליים ודו-גדיליים.

הנח את השקופיות במגש ג'ל המכיל מאגר אלקטרופורזה. התחל אלקטרופורזה.

בהיותו טעון שלילי, ה- DNA נמשך לעבר האנודה החיובית. מקטעי ה-DNA הפגועים נודדים החוצה מהגרעין ועוברים דרך מטריצת הג'ל הנקבובית, כאשר מקטעים ארוכים יותר נעים לאט יותר משברים קצרים יותר. נהפוך הוא, DNA לא פגום אינו נודד בקלות, ונשאר בתוך הגרעין.

לאחר אלקטרופורזה, צבעו את התאים בתמיסת צבע של חומצת גרעין פלואורסצנטית. מולקולות הצבע נקשרות ל-DNA.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תאים בודדים המכילים DNA פגום מציגים מבנה שביט פלואורסצנטי. 'ראש' השביט מייצג DNA לא פגום, בעוד שה'זנב' מורכב מקטעי DNA פגומים.

האורך והעוצמה של 'זנב' השביט מצביעים על היקף הנזק ל-DNA בתאי סרטן בודדים שטופלו בכימותרפיה.

שלב את תרחיף התא עם אגרוז נקודת התכה נמוכה מותכת של 1%, ביחס נפח של 1:10. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ומיד פיפטה 30 מיקרוליטר על שקופית. השתמש בצד של קצה הפיפטה כדי לפזר את תערובת תאי האגרוז כדי להבטיח היווצרות שכבה דקה. הניחו את המגלשות שטוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 10 דקות. טבלו את המגלשות בתמיסת ליזה של 4 מעלות צלזיוס, בחושך למשך שעה עד לילה.

לבדיקת השביט האלקליין, הסר בעדינות שקופיות מתמיסת הליזיס, נקז עודפי נוזלים וטבל בעדינות שקופיות ב-AES, בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר ל-DNA להתפרק.

הוסף AES מקורר מראש במגש ההחלקה של האלקטרופורזה. אין לחרוג מ-0.5 ס"מ מעל המגלשות. מניחים את השקופיות בפנים, ומכסים במכסה. הגדר את מתח אספקת החשמל ל-1 וולט לסנטימטר, והפעל ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השלמת האלקטרופורזה, רוקנו עודפי AES מהשקופיות.

טבלו בעדינות את המגלשות פעמיים, במים מזוקקים בטמפרטורת החדר, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, טבלו בעדינות את השקופיות באתנול 70% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

התחל בהליך הצביעה על ידי ייבוש השקופיות בחושך בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, הניחו 50 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת חומצות גרעין פלואורסצנטיות ירוקות על האגרוז המיובש של כל שקופית, וצבעו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שוטפים את השקופיות לזמן קצר במים מזוקקים, ומייבשים לחלוטין בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך.