דף SDS ללא חיזור: שיטה לניתוח קומפלקסים של חלבון מולטימרי המקושר לדיסולפיד

חלבונים מולטימריים מיוצבים על ידי קשרים בין-מולקולריים, קוולנטיים, דיסולפידים בין שאריות הציסטאין שלהם, דבר חיוני לשמירה על שלמותם המבנית והתפקודית.

כדי לנתח קומפלקסים כאלה על ידי PAGE שאינו מפחית, קח את הריכוז הרצוי של חלבונים מיוצבים בדיסולפיד. הוסף מאגר דגימה שאינו מפחית וחמם את הדגימה.

מאגר זה מכיל SDS, המעניק מטען שלילי כללי לחלבונים, וצבע מעקב כדי להמחיש את תנועתם בג'ל. המאגר חסר כל חומר מפחית, המאפשר לקשרי הדיסולפיד להישאר ללא פגע, מה שמקל על הקומפלקס המולטימרי להישאר שלם.

טען את המתחמים הבודדים לבארות של ג'ל הפוליאקרילאמיד באחוז הרצוי, שהורכב מראש במנגנון ג'ל. הוסף סולם חלבון בגודל ידוע בבאר אחרת. טבלו את הבארות במאגר פועל מבוסס SDS וחברו את המכשיר לאספקת חשמל.

הזרם החשמלי מאלץ את מתחמי החלבון הטעונים שלילית לנוע דרך נקבוביות הג'ל לכיוון האנודה - הטרמינל החיובי. מכיוון שמתחמי החלבון טעונים שלילית באופן אחיד, ההפרדה מתרחשת על סמך גודל, כאשר המולטימרים יוצרים פס בולט במשקל מולקולרי גבוה יותר במיקום מסוים.

השווה את גודל רצועת החלבון המופרדת לסולם. היעדר רצועות משקל מולקולרי נמוכות יותר בג'ל מאשר את ההפרדה המוצלחת של הקומפלקסים המולטימריים השלמים.

הכן 1 ליטר של מאגר ריצה 1X Tris-glycine על ידי ערבוב של 25 מילי-מולרי Tris, 192 מילי-מולרי גליצין ו-0.1% משקל לנפח SDS. לאחר מכן, הגדר את מנגנון הריצה SDS-PAGE.

פתח את חבילת ה-TGX SDS-PAGE של 16% יצוקה מראש לפי פרוטוקול היצרן, והסר את הקלטת. הסר את המסרק שמצפה את הבארות, ואת הסרט מתחתית הקסטה, והנח את הג'ל במנגנון הריצה. מלאו את החדר במאגר הריצה 1X, עד שהבארות שקועות בנוזל.

בעזרת פיפטה מפלסטיק יש לשטוף את הבארות עם המאגר הזורם. טען את הדגימות על הג'ל יחד עם 10 מיקרוליטר של הסמן הסטנדרטי המוכתם מראש. לבסוף, הפעל את הג'ל ב -200 וולט עד שחזית הצבע תהיה כסנטימטר אחד מתחתית הג'ל.