היישום של קשירת העורקים התיכון הקבע מוחין העכבר
25 ביולי 2011
התיכון קשירת מוחין (MCA) עורק היא טכניקה כדי ללמוד איסכמיה מוחית מוקד במודלים של בעלי חיים. בשיטה זו, עורק המוח האמצעי הוא נחשף על ידי craniotomy ו ligated על ידי צריבה. שיטה זו נותנת כרכים האוטם לשעתקו מאוד והגדילה שלאחר הניתוח שיעורי ההישרדות בהשוואה לשיטות אחרות שקיימות.
המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור איסכמיה מוחית מוקדית במודלים של בעלי חיים. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חתך קטן בעור בין העין השמאלית לבסיס האוזן. לאחר מכן, מבוצעת קרניאוטומיה במפגש שבין הקשת הזייגומטית לעצם הסקוואמה כדי לחשוף את העורק המוחי האמצעי, ולאחר מכן קושרים את העורק המוחי האמצעי באמצעות מכשיר לצריבת כלי דם קטנים.
לבסוף, תופרו העור כדי לסגור את הפצע. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אוטם הממוקם בהמיספירה השמאלית של מוח העכבר. ניתן לצבוע את המוח ב-TTC או לסרוקו באמצעות MRI לצורך ויזואליזציה של השבץ.
ניתן להשתמש במוח לאחר שבץ גם לקביעת ביטוי של חלבונים או mRNA. שלום, אני Garza Chola, סטודנט לתואר שני במעבדה של Gale Johnson באוניברסיטת רוצ'סטר.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השבץ המוחי, כגון הדגמת המנגנונים המובילים למות תאים במוח איסכמי. כדי להתכונן לניתוח, יש לעקר את כל כלי הניתוח, ספוגי הגזה והאפליקטורים הקוגניטיביים באמצעות אוטוקלאב. יש לשמור את כלי הניתוח ב-70% ethanol במהלך הניתוח ולייבש אותם באוויר על גזה סטרילית רגע לפני השימוש.
רססו את אזור העבודה ב-70% ethanol שעתיים לפני הניתוח. מזריקו לעכבר 0.05 milligrams per kilogram של buprenorphine. התרופה תנתן שוב מיד לאחר הניתוח, ולאחר מכן כל שלוש עד חמש שעות במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר הניתוח.
השתמש במאייד חומרי הרדמה כדי להרדים את העכבר באמצעות תערובת גזים של 3% ISO fluorine ו-20% oxygen. כוונן את כמות ה-oxygen באמצעות מד זרימה. בדוק את רמת ההרדמה על ידי צביטה של הבוהן או הזנב.
שמור על רמת ההרדמה באמצעות 2% ISO fluorine. טפטף דמעות מלאכותיות לעיני העכבר והקפד על זהירות כדי למנוע פגיעה בעין במהלך ההליך הכירורגי.
הניחו את העכבר על צדו הימני בתנוחה צדית (lateral) והשתמשו במכונת גילוח לבעלי חיים. גלחו את האזור בצד שמאל שבין העין השמאלית לבסיס האוזן השמאלית. נקו את האזור על ידי שפשוף קל באמצעות מקלוני צמר גפן, תוך מעבר{(-}חלופין{(-)}בין תמיסת Betadine לבין 70%eth ethanol.
יש לחזור על הפעולה. הנח את העכבר על פד חימום המחובר לגשש רקטלי. כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 °C, הכנס את הגשש הרקטלי באמצעות שמן מינרלי. מקם את העכבר על צדו הימני תחת המיקרוסקופ וקבע אותו בעזרת סרט הדבקה.
גזרו חלון בספוג גזה וכסו את אזור הניתוח בעזרת מספריים ישרים ועדינים. בצעו חתך אנכי בין העין השמאלית לבסיס האוזן השמאלית. השתמשו בתפסני עצירה (hemostats) מעוקלים כדי להשאיר את אזור הניתוח פתוח במידה ומתרחשת התייבשות מוגברת של הרקמה במהלך הניתוח.
השתמשו במקלוני צמר להחלת PBS סטרילי. השתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך אופקי בשריר הרקה (temporal muscle) ומשכו באיטיות בעזרת פינצטה כדי להפריד מעט את שריר הרקה מהגולגולת. החזיקו את עצם הלסת בעזרת פינצטה מעוקלת והשתמשו במחט בכישור 18 (18 gauge) כדי לבצע קרניאוטומיה סוב-טמפורלית (subtemporal craniotomy) קטנה בחיבור שבין הקשת הזיגומטית (zygomatic arch) לעצם הרקה (squam sole bone).
בעזרת מסורי עצם, מסירים חלקים קטנים מהגולגולת כדי לחשוף את ה-MCA. יש להקפיד שלא לפגוע בקשת העיגולית (zygomatic arch) ובתוכן המסלול במהלך תהליך זה. באמצעות כויה לכלי דם קטנים, קשרו את החלק הדיסטלי של ה-MCA, החזירו את השריר הרקה למקומו המקורי, והשתמשו בתפרים של ניילון 5/0.
כדי לסגור את נקודת החתך, הפסיקו את ההרדמה והוציאו את הגשוש הרקטלי. מזריקו לעכבר מנה שנייה של buprenorphine תת-עורית. החזירו את העכבר לכלוב, שנשמר בטמפרטורה של 37 °C.
עם פאנל חימום. יש לנטר את העכבר מקרוב במהלך 24 השעות הבאות כדי לזהות כל סימן לאי-נוחות, כולל ירידה בתיאבון או בצריכת המים, תנוחה שפופה, נשימה מוגברת או פריכת שיער (piloerection). ספקו לעכבר ג'ל התאוששות מיד לאחר הניתוח.
המתינו שעתיים עד שלוש שעות לאחר הניתוח. לאחר מכן, הזריקו לעכבר buprenorphine תת-עורית כל שלוש עד חמש שעות, למשך עד 24 שעות. 24 שעות לאחר הניתוח, הרדימו את העכבר הרדמה עמוקה ובצעו פרפוזיה עם 4%TTC.
הוציאו את המוח והניחו אותו בתמיסת 4%paraform aldehyde למשך לילה. למחרת, מקמו את המוח בבלוק החתך. השתמשו בלהבי תער כדי לחתוך את המוח לפרוסות בעובי של one millimeter.
הניחו את הפרוסות לצד סרגל מילימטרי. צלמו את הפרוסות באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ דיסקציוני, באמצעות תוכנת Image J.
לחצו על תפריט הקבצים ופתחו את התמונה הרצויה. לחצו על לשונית הקו הישר בתוכנה. שרטטו קו ישר בין שני השוליים בסרגל.
לחצו על תפריט הניתוח (analyze) ובחרו ב"קביעת קנה מידה" (set scale). הגדירו את המרחק הידוע כ-one ואת יחידת האורך כ-millimeter. לחצו על לשונית "מעגל ידני" (freehand circle).
שרטטו עיגול כדי להקיף את ההמיספרה הנגדית. לחצו על תפריט analyze ובחרו ב-measure. ייפתח חלון חישוב המציג את שטח העיגול ששורטט.
שרטטו מעגל נוסף סביב ההמיספירה האיפסילטרלית, למעט אזור קו השרטוט הלבן. מדדו את השטח כפי שהודגם קודם לכן. הערך החדש יתווסף לחלון החישוב.
ההפרש בין הערך הראשון לשני מייצג את שטח האוטם. חשבו את שטח השבץ בכל פרוסה על ידי חזרה על השלבים לעיל עבור עובי פרוסה של 1 mm. חשבו את נפח השבץ על ידי סיכום שטח השבץ שחושב בכל פרוסה.
איור זה מציג את צביעת ה-TTC של המוח 24 שעות לאחר קשירה קבועה של ה-MCA בעכבר מסוג wild type C 57 BL six. אתר השבץ נראה בצבע לבן וניתן להשקיפו בהגדלות ובזוויות שונות. מוצגות כאן פרוסות בעבי של מילימטר אחד של מוח פגוע בשבץ שנצבע ב-TTC, מהחלק הקדמי לחלק האחורי של האזור הנמק (infarct).
הנפח חושב 24 שעות לאחר הניתוח. נפח האינפארקט הוא כ-23 מילימטרים מעוקבים. טכניקה זו ניתנת לביצוע בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
תודה לצפייה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקת קשירת העורק המוחה האמצעי (MCA) משמשת לחקר איסכמיה מוחית מוקדית במודלים של בעלי חיים. שיטה זו כוללת חשיפה וקשירה של העורק המוחה האמצעי, מה שמוביל לנפחי אינפארקט הניתנים לשחזור ולשיעורי הישרדות משופרים לאחר הניתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- מחקר שבץ מוחי
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- איסכמיה מוחית מוקדית היא תחום מחקר קריטי להבנת שבץ מוחי.
- שיטת הליגציה של ה-MCA מאפשרת ניסויים מבוקרים.
- מודלים של בעלי חיים מספקים תובנות לגבי מנגנוני השבץ בבני אדם.
- שיעורי הישרדות משופרים מגבירים את מהימנות התוצאות.
מטרת המחקר
- לחקירת ההשפעות של איסכמיה מוחית מוקדית.
- להערכת נפחי השבץ (infarct volumes) בסביבה מבוקרת.
- לשיפור ההבנה של הפתולוגיה של שבץ מוחי.
שיטות שהשתמשו בהן
- ביצוע חתך בין העין השמאלית לבסיס האוזן.
- ביצוע קרניאוטומיה (פתיחת גולגולת) באזור הקשת הזיגומטית ועצם הסקומה.
- קישור (ליגציה) של העורק המוחי האמצעי באמצעות מכשיר כהה (cauterizer) לכלי דם קטנים.
- תפירת העור לסגירת הפצע לאחר הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- השבץ (Infarct) ממוקם בהמיספירה השמאלית של מוח העכבר.
- הדמיה של השבץ הושגה באמצעות צביעת TTC או MRI.
- התוצאות מדגימות את יעילותה של טכניקת הליגציה של ה-MCA.
- נצפתה הדירות גבוהה של נפחי השבץ.
מסקנות
- ליגציה של ה-MCA היא שיטה מהימנה לחקר איסכמיה מוחשית של המוח.
- שיעורי הישרדות משופרים תורמים לתקפות הממצאים.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו למחקר נוסף של טיפולים בשבץ מוחי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל קשירת העורק המוחי האמצעי (MCA) הקבועה מספק מערכת הניתנת לשחזור לבחינת איסכמיה מוחית מוקדית, ומאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תרכובות נוירופרוטקטיביות במחקר פרה-קליני של שבץ מוחי. באמצעות יצירת נפחי אינפארקט עקביים בעכברים, שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור מועמדים טיפוליים המענים לצורך לא מסופק בטיפול בשבץ איסכמי. הרלוונטיות של המודל לפתולוגיה אנושית — שבה כ-80% מהשבץ המוחים מתרחשים בטריטוריה של ה-MCA — מגבירה את הביטחון הטרנסלציונלי ואת מיון הפורטפוליו בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במסלולים איסכמיים באמצעות השראה מבוקרת של איסכמיה מוקדית.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת מעורבות המטרה ביצירת ליבת האוטם (infarct core) והפניברה (penumbra).
- ערך תפעולי: מספק כימות הדיר ביצועים של האוטם באמצעות צביעת TTC, מה שמקל על הערכה עקבית של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקתקות לסריקת תרכובות באמצעות ביסוס של מודל איסכמיה רלוונטי למחלה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת השבץ (infarct) באמצעות וולומטריה מבוססת TTC, המאפשרת ניתוח כמותי של תגובת מינון.
- ערך תפעולי: שיפור השחזוריות של הבדיקה עם שיעורי הישרדות של ~80%, המפחיתים את השונות במדדים הפארמקולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה פתולוגיה של שברה בבני אדם עם רלוונטיות אנטומית ופתופיזיולוגית גבוהה לאוטמי של טריטוריית ה-MCA.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של מנגנוני תגובה להיפוקסיה תוך-תאית in vivo, ובכך תומך בגילוי ביומרקרים.
- ערך תפעולי: מספק המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של ניתוח וצביעה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך מספקת פלטפורמה להפחתת סיכונים מכניסטיים של תרופות לטיפול בשבץ מוחי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של יעדים נוירו-פרוטקטיביים על ידי מתן אפשרות להשראת פגיעה איסכמיה מבוקרת וכמותית של האספקט האינפארקט.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות צביעת TTC סטנדרטית, המניבה נתונים כמותיים של נפח האינפארקט לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות נפחיות (למשל, אינפארקט של ~23 mm³ לאחר 24h) המאפשרות השוואה בין תנאים שונים וקביעת גודל האפקט.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות לוקליזציה של האינפארקט המשקפת דפוסי שבץ אנושיים, ובכך מסייעת לקידום מותאם סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות מרובות במפני פרויקטים שונים, הודות ליכולת השחזור שלה ולנקודות סיום סטנדרטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים איסכמיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נהלי קרניוטומיה, ליגציה וצביעת TTC סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים אמינים על אוטם, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למחקר שבץ מוחי.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לנוירופרוטקציה על בסיס אותות יעילות פרה-קליניים עקביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה של מכרסמים וזיהוי נוירו-אנטומי של ה-MCA.
- תלוי בציוד מיקרו-כירורגי הכולל מכשירי כauterization של כלי דם, פדי חימום וכלי תפירה מדויקים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הרדמה, אלגזיה וניטור לאחר ניתוח.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת טכניקות ממודלי חולדה למודלי עכבר, לרבות גודל התפר ודיוק החסימה.
- מוגבל בשל הצורך בנקודות סיום טרמינליות לצורך כימות השבץ באמצעות צביעת TTC או MRI.
