היישום של קשירת העורקים התיכון הקבע מוחין העכבר
25 ביולי 2011
התיכון קשירת מוחין (MCA) עורק היא טכניקה כדי ללמוד איסכמיה מוחית מוקד במודלים של בעלי חיים. בשיטה זו, עורק המוח האמצעי הוא נחשף על ידי craniotomy ו ligated על ידי צריבה. שיטה זו נותנת כרכים האוטם לשעתקו מאוד והגדילה שלאחר הניתוח שיעורי ההישרדות בהשוואה לשיטות אחרות שקיימות.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור איסכמיה מוחית מוקדית במודלים של בעלי חיים. הדבר מבוצע תחילה על ידי ביצוע חתך קטן בעור בין העין השמאלית לבסיס האוזן. לאחר מכן, מבוצעת קרניאוטומיה בחיבור שבין הקשת העילית (zygomatic arch) לעצם הקשקשת (squamal bone) כדי לחשוף את העורק המוחי האמצעי, ולאחר מכן נקשר העורק המוחי האמצעי באמצעות מכשיר לצריבה של כלי דם קטנים.
לבסוף, תופרים את העור כדי לסגור את הפצע. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אוטם הממוקם בחצי הכדור השמאלי של מוח העכבר. ניתן לצבוע את המוח ב-TTC או לסרוקו באמצעות MRI לצורך ויזואליזציה של השבץ.
ניתן להשתמש גם במוח לאחר שבץ לצורך קביעה של ביטוי חלבונים או mRNA. שלום, אני Garza Chola, סטודנטית לתואר שני במעבדה של Gale Johnson באוניברסיטת רוצ'סטר.
שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השבץ המוחי, כגון הדגמת המנגנונים המובילים למות תאים במוח איסכמי. כדי להתכונן לניתוח, יש לעקר את כל המכשירים הכירורגיים, ספגי הגזה והאפליקטורים הקוגניטיביים באמצעות אוטוקלאב. יש לשמור את כלי הניתוח ב-70% ethanol במהלך הניתוח ולייבש אותם באוויר על גזה סטרילית מיד לפני השימוש.
יש לרסס את אזור העבודה ב-70% ethanol שעתיים לפני הניתוח. יש להזריק לעכבר 0.05 milligrams per kilogram של buprenorphine. התרופה תינתן שוב מיד לאחר הניתוח, ולאחר מכן מדי שלוש עד חמש שעות במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח.
השתמש במאדה חומרי הרדמה כדי להרדימ את העכבר באמצעות תערובת גזים של 3% ISO fluorine ו-20% oxygen. כוונן את כמות החמצן בעזרת מד זרימה. בדוק את רמת ההרדמה באמצעות צביטה של בהונות או של הזנב.
שמר את רמת ההרדמה באמצעות 2% ISO fluorine. טפטף דמעות מלאכותיות לעיני העכבר והיזהר לא לגרום נזק לעין במהלך ההליך הכירורגי.
הנח את העכבר על צדו הימני בתנוחה לטרלית באמצעות מכשיר גזוזת בעלי חיים. גלח את האזור בצד שמאל בין העין השמאלית לבסיס האוזן השמאלית. נקה את האזור על ידי חילופיטם בין תמיסת Betadine לבין 70%eth ethanol באמצעות מקלוני צמר גפן ושפשוף קל של האזור.
יש לחזור על הפעולה. הניחו את העכבר על משטח חימום המחובר לגשש רקטלי. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב-37 °C, הכניסו את הגשש הרקטלי תוך שימוש בשמן מינרלי. מקמו את העכבר על צדו הימני תחת המיקרוסקופ ואבטחו אותו באמצעות סרט הדבקה.
גזרו חלון בספוג גזה וכסו את אזור הניתוח באמצעות מספריים ישרים ועדינים. בצעו חתך אנכי בין העין השמאלית לבסיס האוזן השמאלית. השתמשו בתסמיכי דם (hemostats) מעוקלים כדי להשאיר את אזור הניתוח פתוח אם מתרחשת התייבשות מופרזת של הרקמה במהלך הניתוח.
יש להשתמש במקלונים עם טיפ צמר להחלת PBS סטרילי. השתמש במספרי קפיץ כדי לבצע חתך אופקי בשריר הרקה (temporal muscle), ומשוך לאט בעזרת פינצטה כדי להפריד מעט את שריר הרקה מהגולגולת. החזק את עצם הלסת באמצעות פינצטה קמורה והשתמש במחט בכיל 18 כדי לבצע קרניוטומיה סוב-טמפורלית (subtemporal craniotomy) קטנה בחיבור שבין הקשת הזיגומטית (zygomatic arch) לבין עצם הקשקש (squamosal bone).
בעזרת מסורי עצם מסירים חתיכות קטנות מהגולגולת כדי לחשוף את ה-MCA. יש להקפיד שלא לפגוע בקשת העיגולית (zygomatic arch) ובתכולת מגרת העין במהלך תהליך זה. באמצעות צריבה של כלי דם קטנים, קשרו את החלק הדיסטלי של ה-MCA, החזירו את השריר הרקותי למקומו המקורי, והשתמשו בתפרי nylon 5-0.
לסגירת אתר החיתוך, הפסיקו את ההרדמה והוציאו את הגשש הרקטלי. מזריקו לעכבר מנה שנייה של buprenorphine באופן תת-עורי. החזירו את העכבר לכלוב, שנשמר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.
עם פאנל חימום. יש לעקוב מקרוב אחר העכבר במשך 24 השעות הבאות כדי לזהות כל סימני אי-נוחות, כולל ירידה בתיאבון או בצריכת מים, תנוחה שפופה, נשימה מואצת או פרווה זקופה (piloerection). ספקו לעכבר ג'ל התאוששות מיד לאחר הניתוח.
המתינו שעתיים עד שלוש שעות לאחר הניתוח. לאחר מכן, הזריקו לעכבר buprenorphine תת-עורית כל שלוש עד חמש שעות, למשך עד 24 שעות. 24 שעות לאחר הניתוח, הרדימו את העכבר הרדמה עמוקה ובצעו פרפוזיה של העכבר עם 4% TTC.
הוצא את המוח והנח אותו בתמיסת 4% paraform aldehyde למשך לילה. למחרת, מקם את המוח בבלוק החיתוך. השתמש בלהבי תער כדי לחתוך את המוח לפרוסות בעובי של 1 mm.
הניחו את הפרוסות לצד סרגל מילימטרים. צלמו את הפרוסות באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ דיסקציה, לתוך תוכנת Image J.
לחצו על תפריט הקבצים ופתחו את התמונה הרצויה. לחצו על לשונית הקו הישר בתוכנה. שרטטו קו ישר בין שני השוליים בסרגל.
לחצו על תפריט Analyze ובחרו ב-Set Scale. הגדירו את המרחק הידוע כ-1 ואת יחידת האורך כ-millimeter. לחצו על לשונית Freehand Circle.
שרטטו עיגול כדי להקיף את ההמיספרה הנגדית. לחצו על תפריט analyze ובחרו ב-measure. יקפוץ חלון חישוב המציג את שטח העיגול ששורטט.
שרטטו מעגל נוסף מסביב להמיספרה האיפסילטרלית, למעט את שטח קו המשיכה הלבן. מדדו את השטח כפי שהודגם קודם לכן. הערך החדש יתווסף לחלון החישוב.
ההפרש בין הערך הראשון לשני מייצג את שטח האוטורקט (Infarct). חשבו את שטח השבץ בכל פרוסה על ידי חזרה על השלבים שלעיל עבור עובי פרוסה של מילימטר אחד. חשבו את נפח השבץ על ידי סכימת שטח השבץ שחושב בכל פרוסה.
איור זה מציג את צביעת ה-TTC במוח 24 שעות לאחר ליגציה קבועה של ה-MCA בעכבר מסוג C 57 BL six wild type. אתר השבץ מופיע בצבע לבן וניתן להבחין בו מהגדלות וזוויות שונות. מוצגים כאן פרוסות בעובי של מילימטר אחד של מוח פגוע בשבץ שנצבע ב-TTC, מהחלק הקדמי לחלק האחורי של האוטם.
הנפח חושב 24 שעות לאחר הניתוח. נפח השבץ הוא בערך 23 מילימטרים מעוקבים. טכניקה זו יכולה להסתיים בתוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
תודה שצפיתם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקת קשירת העורק המוחה האמצעי (MCA) משמשת לחקר איסכמיה מוחית מוקדית במודלים של בעלי חיים. שיטה זו כוללת חשיפה וקשירה של העורק המוחה האמצעי, מה שמוביל לנפחי אינפארקט הניתנים לשחזור ולשיעורי הישרדות משופרים לאחר הניתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- מחקר שבץ מוחי
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- איסכמיה מוחית מוקדית היא תחום מחקר קריטי להבנת שבץ מוחי.
- שיטת הליגציה של ה-MCA מאפשרת ניסויים מבוקרים.
- מודלים של בעלי חיים מספקים תובנות לגבי מנגנוני השבץ בבני אדם.
- שיעורי הישרדות משופרים מגבירים את מהימנות התוצאות.
מטרת המחקר
- לחקירת ההשפעות של איסכמיה מוחית מוקדית.
- להערכת נפחי השבץ (infarct volumes) בסביבה מבוקרת.
- לשיפור ההבנה של הפתולוגיה של שבץ מוחי.
שיטות שהשתמשו בהן
- ביצוע חתך בין העין השמאלית לבסיס האוזן.
- ביצוע קרניאוטומיה (פתיחת גולגולת) באזור הקשת הזיגומטית ועצם הסקומה.
- קישור (ליגציה) של העורק המוחי האמצעי באמצעות מכשיר כהה (cauterizer) לכלי דם קטנים.
- תפירת העור לסגירת הפצע לאחר הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- השבץ (Infarct) ממוקם בהמיספירה השמאלית של מוח העכבר.
- הדמיה של השבץ הושגה באמצעות צביעת TTC או MRI.
- התוצאות מדגימות את יעילותה של טכניקת הליגציה של ה-MCA.
- נצפתה הדירות גבוהה של נפחי השבץ.
מסקנות
- ליגציה של ה-MCA היא שיטה מהימנה לחקר איסכמיה מוחשית של המוח.
- שיעורי הישרדות משופרים תורמים לתקפות הממצאים.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו למחקר נוסף של טיפולים בשבץ מוחי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל קשירת העורק המוחי האמצעי (MCA) הקבועה מספק מערכת הניתנת לשחזור לבחינת איסכמיה מוחית מוקדית, ומאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תרכובות נוירופרוטקטיביות במחקר פרה-קליני של שבץ מוחי. באמצעות יצירת נפחי אינפארקט עקביים בעכברים, שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור מועמדים טיפוליים המענים לצורך לא מסופק בטיפול בשבץ איסכמי. הרלוונטיות של המודל לפתולוגיה אנושית — שבה כ-80% מהשבץ המוחים מתרחשים בטריטוריה של ה-MCA — מגבירה את הביטחון הטרנסלציונלי ואת מיון הפורטפוליו בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במסלולים איסכמיים באמצעות השראה מבוקרת של איסכמיה מוקדית.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת מעורבות המטרה ביצירת ליבת האוטם (infarct core) והפניברה (penumbra).
- ערך תפעולי: מספק כימות הדיר ביצועים של האוטם באמצעות צביעת TTC, מה שמקל על הערכה עקבית של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקתקות לסריקת תרכובות באמצעות ביסוס של מודל איסכמיה רלוונטי למחלה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת השבץ (infarct) באמצעות וולומטריה מבוססת TTC, המאפשרת ניתוח כמותי של תגובת מינון.
- ערך תפעולי: שיפור השחזוריות של הבדיקה עם שיעורי הישרדות של ~80%, המפחיתים את השונות במדדים הפארמקולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה פתולוגיה של שברה בבני אדם עם רלוונטיות אנטומית ופתופיזיולוגית גבוהה לאוטמי של טריטוריית ה-MCA.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של מנגנוני תגובה להיפוקסיה תוך-תאית in vivo, ובכך תומך בגילוי ביומרקרים.
- ערך תפעולי: מספק המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של ניתוח וצביעה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך מספקת פלטפורמה להפחתת סיכונים מכניסטיים של תרופות לטיפול בשבץ מוחי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של יעדים נוירו-פרוטקטיביים על ידי מתן אפשרות להשראת פגיעה איסכמיה מבוקרת וכמותית של האספקט האינפארקט.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות צביעת TTC סטנדרטית, המניבה נתונים כמותיים של נפח האינפארקט לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות נפחיות (למשל, אינפארקט של ~23 mm³ לאחר 24h) המאפשרות השוואה בין תנאים שונים וקביעת גודל האפקט.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות לוקליזציה של האינפארקט המשקפת דפוסי שבץ אנושיים, ובכך מסייעת לקידום מותאם סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות מרובות במפני פרויקטים שונים, הודות ליכולת השחזור שלה ולנקודות סיום סטנדרטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים איסכמיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נהלי קרניוטומיה, ליגציה וצביעת TTC סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים אמינים על אוטם, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למחקר שבץ מוחי.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לנוירופרוטקציה על בסיס אותות יעילות פרה-קליניים עקביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה של מכרסמים וזיהוי נוירו-אנטומי של ה-MCA.
- תלוי בציוד מיקרו-כירורגי הכולל מכשירי כauterization של כלי דם, פדי חימום וכלי תפירה מדויקים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הרדמה, אלגזיה וניטור לאחר ניתוח.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת טכניקות ממודלי חולדה למודלי עכבר, לרבות גודל התפר ודיוק החסימה.
- מוגבל בשל הצורך בנקודות סיום טרמינליות לצורך כימות השבץ באמצעות צביעת TTC או MRI.
