אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

לאלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל של תערובת חלבונים שמקורה ברקמת גידול הומוגנית, יש לטפל במאגר המכיל צ'אוטרופים, חומר ניקוי zwitterionic וחומר מחזר. צ'אוטרופים וחומרי ניקוי מפרקים ומסיסים את החלבונים. חומרי הפחתה מפחיתים את קשרי הדיסולפיד של החלבונים, יוצרים קבוצות תיול חופשיות ופותחים את החלבונים לרזולוציה אופטימלית של החלבון.

העבירו את תערובת החלבון המטופלת לשיפוע pH משותק, IPG, מחזיק רצועה. הנח רצועת IPG הכוללת שיפוע pH ליניארי בתוך מטריצת הג'ל האקרילאמיד. הוסף שמן מינרלי למניעת אידוי תמיסת חלבון. העבר את המחזיק למערכת IEF עם מיקוד איזואלקטרי. אפשר לתמיסת החלבון להחזיר לחות לרצועה.

בצע IEF של הממד הראשון. הזרם החשמלי גורם לחלבונים טעונים לנדוד דרך שיפוע ה- pH לעבר אלקטרודות טעונות הפוכות, ומשתקים בנקודות האיזואלקטריות שלהם - pH שבו לחלבונים יש מטען נטו אפס.

לאחר IEF, טפל ברצועת ה-IPG עם נתרן דודציל סולפט, SDS, חומר ניקוי אניוני המעניק מטען שלילי לחלבונים. שיווי משקל עם חומר אלקילציה כדי לשנות את קבוצות החלבון תיול, מה שמבטיח מסיסות חלבון במהלך אלקטרופורזה.

טען את הרצועה על ג'ל ממיס פוליאקרילאמיד בעל נקבוביות קטנות מראש ואבטח עם אגרוז מותך. מלאו את התאים במאגר אלקטרופורזה המכיל SDS. ליזום אלקטרופורזה של הממד השני, בניצב ל-IEF.

חלבונים בעלי משקל מולקולרי גדול יותר וטעונים שלילית נעים דרך הג'ל לאט לכיוון האנודה הטעונה חיובית מאשר חלבונים קטנים יותר, מה שמקל על הפרדה מבוססת גודל.

מכתים את הג'ל. ניתן לדמיין חלבונים ככתמים נפרדים על הג'ל.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת דגימת חלבון שהוכנה בעבר לכל חריץ של מחזיק רצועות IPG בגודל 13 סנטימטר. יש להניח רצועת IPG בגודל 18 סנטימטר, עם הצד הג'ל כלפי מטה, על כל תמיסת דגימת חלבון, תוך הקפדה על הימנעות מבועות. לאחר מכן, הוסף 3 עד 4 מיליליטר שמן מינרלי כדי לכסות כל רצועת IPG.

לאחר מכן, הרכיבו כל מחזיק רצועת IPG למערכת מיקוד איזואלקטרית, כאשר הקצה המחודד על הצלחת האחורית, והקצה המרובע על הצלחת הקדמית. לאחר החזרת רצועות ה-IPG למשך 18 שעות בטמפרטורת החדר, הגדר את פרמטרי ה-IEF במערכת המיקוד האיזואלקטרית עם זמן ריצה כולל של 7.5 שעות ו-36,875 וולט שעות.

לאחר IEF, הוצא כל רצועת IPG ממערכת המיקוד האיזואלקטרית, והסר את עודפי השמן המינרלי בעזרת מגבת נייר בלתי מסיסה. לאחר מכן, עוטפים כל רצועה בדף ניילון, ושומרים בחום של -80 מעלות צלזיוס.

כדי להטיל ג'ל 12% PAGE, הוסיפו מים מזוקקים כפולים, 1.5 מולרית Tris-hydrochloric buffer, 40% תמיסת מלאי אקרילאמיד/ביסקרילאמיד, 10% אמוניום פרסולפט ו-TEMED לכוס. מערבבים את תמיסת הג'ל בעדינות, מקפידים להימנע מבועות.

יוצקים בעדינות את תמיסת הג'ל לתא רב יציקה, עד לגובה הג'ל הצפוי של 19 סנטימטרים. מיד, הוסף כ-3 מיליליטר מים מזוקקים כפולים לתא הרב-יציקה כדי לכסות כל ג'ל ממיס, ואפשר לכל ג'ל להתפלמר למשך כשעה.

שלב זה חשוב מאוד להכנת ג'ל SDS-PAGE איכותי. יש להוסיף מיד מים בנפח שווה על גבי כל ג'ל.

הכן שני ליטר של מאגר אלקטרופורזה, ולאחר מכן, הוסף את המאגר למיכל חיץ יחידת הפרדת אלקטרופורזה.

לאחר הוצאת רצועות ה-IPG הממוקדות מהמקפיא, הניחו אותן בכלי פלסטיק המכיל 1 מיליליטר של מאגר שיווי משקל מפחית ועקבות של ברומופנול כחול, ואזנו אותן למשך 10 דקות עם נדנוד עדין. לאחר הסרת מאגר שיווי המשקל המפחית, הוסף 4 מיליליטר של מאגר שיווי משקל אלקילציה, ועקבות של ברומופנול כחול לרצועות ה-IPG, ואזן אותם למשך 10 דקות עם נדנוד עדין.

במהלך שיווי משקל הג'ל, פרק את תא הרב-יציקה והסר את קלטת הג'ל המוכנה. שוטפים את קלטת הג'ל שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים, ואז מוציאים עודפי מים מקלטת הג'ל בעזרת מגבת נייר בלתי מסיסה, ומניחים אותה במעמד ג'ל.

לאחר מכן, שטפו את רצועות ה-IPG המאוזנות עם מאגר אלקטרופורזה, והסר עודפי נוזלים על כל משטח רצועת IPG בעזרת מגבת נייר בלתי מסיסה. הנח פס IPG על ג'ל ה-SDS-PAGE המתפוגג, ואפשר לצד הפלסטיק של פס ה-IPG ליצור קשר עם לוחית הזכוכית הארוכה יותר, כשהקצה המחודד משמאל.

כעת, הוסף במהירות 3 עד 4 מיליליטר של אגרוז חם 1% ומאגר אלקטרופורזה SDS, כדי לאטום את פס ה-IPG בחלק העליון של כל ג'ל SDS-PAGE, ולהניח את הצד העליון של רצועת ה-IPG כלפי מטה על החלק העליון של צלחת הזכוכית הקצרה יותר, תוך הקפדה על הימנעות מבועות.

שלבים אלה חשובים מאוד כדי לאטום את רצועת ה-IPG לג'ל SDS-PAGE. יש להוסיף מיד את תמיסות האגרוז החמות, ולהניח מיד את רצועת ה-IPG בחלק העליון של ג'ל ה-SDS.

לאחר פילמור, הכנס את קלטת הג'ל המורכבת אנכית בין אטמי הפלסטיק למערכת אלקטרופורזה אנכית. מניחים את החלק העליון של הג'ל עם רצועת ה-IPG ליד הקתודה. לאחר מכן, התאם את רמת מאגר האלקטרופורזה כדי לטבול את קלטת הג'ל על ידי הוספת נפח המאגר המתאים למערכת האלקטרופורזה.

חבר והגדר את ספק הכוח במצב מתח קבוע, והפעל ב-200 וולט למשך כ-370 דקות תוך ניטור הצבע. לאחר סיום הריצה, הוציאו את קלטת הג'ל ממערכת האלקטרופורזה והוציאו בעדינות את הג'ל מקלטת הג'ל, תוך הקפדה להימנע מקריעת הג'ל.