אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה: טכניקה אלקטרופורטית לזיהוי מטאלופרוטאזות מטריקס על ידי הערכת הפעילות האנזימטית

מטריקס מטאלופרוטאינאז, או MMP, פרוטאז רב-תחומי, המורכב מפרופפטיד ותחומים קטליטיים, מופרש כאנזים לא פעיל או זימוגן על ידי תאים ספציפיים. האינטראקציה בין יון האבץ בתחום הקטליטי לבין שאריות ציסטאין בתחום הפרופפטיד שומרת על ה-MMP לא פעיל.

כדי לזהות MMPs בתרבית תאים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה, מלא את מיכל האלקטרופורזה המכיל קלטת ג'ל עם נתרן דודציל סולפט או מאגר ריצה המכיל SDS.

טען את הסופרנטנט התרבית מעורבב עם בופר העמסה, ואחריו תקני חלבון, לבארות של ג'ל פוליאקרילאמיד, קופולימר עם מצע חלבון ספציפי ל-MMP.

SDS, חומר ניקוי בעל מטען שלילי, בתנאים שאינם מפחיתים, משבש את אינטראקציות הציסטאין-אבץ ב-MMPs ומפרק את החלבונים תוך הקניית מטען שלילי.

בצע אלקטרופורזה. השדה החשמלי גורם לחלבונים הטעונים שלילית לנדוד לעבר האנודה הטעונה חיובית, מה שגורם להפרדה מבוססת גודל של חלבונים.

לאחר אלקטרופורזה, יש לטפל בג'ל עם מאגר רנטורינג לא יוני המכיל חומר ניקוי. חומרי ניקוי לא יוניים מחליפים SDS, מחדשים חלבונים ומחזירים חלקית את פעילות ה-MMP. MMPs מעובדים למצב פעיל לחלוטין.

דגירה במאגר מתפתח המכיל קטיוני מתכת דו-ערכיים החיוניים לפעילות MMP. MMPs פעילים, יחד עם קטיונים, מעכלים את מצע ה-MMP בג'ל. שוטפים את הג'ל כדי להסיר את המוצרים המעוכלים. מכתים את הג'ל.

אזורי הפעילות של MMP, נטולי מצע MMP, מופיעים כרצועות שקופות על רקע כחול כהה של מצע לא מעוכל. באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן לתאם את עוצמת רצועת הג'ל לפעילות MMP.

לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו את כל מטריצות המטאלופרוטאינאזות, או MMPs, כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים. ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. כאן MMP-2, הידוע גם בשם ג'לטינאז A או קולגנאז מסוג IV, משמש להדגמת הדמיה של פעילות MMP באמצעות זימוגרפיה.

לאחר הכנת אנזימי MMP, השג שקית ג'ל זימוגרמה של 10% ג'לטין המכילה ג'ל בתוך קלטת. שוטפים את הקסטה במים נטולי יונים. הסר את סרט המגן מתחתית הקלטת, ואת המסרק מהחלק העליון של הג'ל. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם מאגר ריצה Tris-Glycine SDS.

הנח את הג'ל במנגנון אלקטרופורזה של מיני תאים, וודא שהצד הקטן יותר של הקסטה פונה פנימה. נעל את הג'ל במקומו עם טריז מתח הג'ל. מלאו את החדר העליון של המכשיר במאגר ריצה Tris-Glycine SDS מעל מפלס הבארות, ובדקו אם יש נזילות. מלא את החדר התחתון של מערך האלקטרופורזה של הג'ל גם במאגר פועל.

לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר של סמן מולקולרי חלבוני.

מערבבים כמות שווה של הדגימה למאגר העמסת ג'ל שאינו מכיל חומרים מחזרים. בניגוד ל-SDS-PAGE רגיל, אין להרתיח את הדגימות, ובמקום זאת להעמיס אותן ישירות לבארות הג'ל, באמצעות טיפים לטעינת ג'ל. בארות אלו יכולות להכיל עד 20 מיקרוליטר נפח.

הנח את המכסה על תא המיני, וחבר את כבלי האלקטרודה לאספקת החשמל. הפעל את ספק הכוח והגדר את הג'ל לפעול על 125 וולט, קבוע למשך 90 דקות. בדוק היווצרות בועות קטנות על חוט החדר התחתון, מה שמעיד על זרימת זרם.

בעת הפעלת הג'ל הראשון, עקוב אחר התקדמות הנדידה כל 15 דקות, תוך שימוש בכחול הברומופנול הכלול במאגר הטעינה כמחוון. עבור כל ג'ל, הכינו 100 מיליליטר של מאגר חידוש זימוגרמה 1X, ו-200 מיליליטר של מאגר מפתח זימוגרמה, שניהם במים נטולי יונים.

כאשר צבע המעקב הכחול ברומופנול מגיע לתחתית הג'ל, כבה את ספק הכוח.

פתח את המיני תא והסר את הג'ל. הפרד את שני צידי הקסטה בעזרת סכין ג'ל. חותכים פינה כדי לסמן את כיוון הג'ל. הסר בזהירות את הג'ל מהקלטת, והניח אותו בכלי עם 100 מיליליטר של חיץ מחדש.

דגרו את הג'ל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה.

הסר את מאגר הרנטורינג, והוסף 100 מיליליטר של חיץ מתפתח לג'ל. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.

לאחר מכן, הסר את המאגר המתפתח והוסף עוד 100 מיליליטר של חיץ מתפתח טרי לג'ל. דגרו את הג'ל למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה למשך הלילה, הסר את המאגר המתפתח, ושטוף את הג'ל על ידי דגירה במים נטולי יונים, בערבול עדין, למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפה זו פעמיים.

הניחו את הג'ל על מגן יריעות פלסטיק, והסירו בועות. לאחר מכן, סרוק את הג'ל עם סורק צילום כדי לשמור את המיקום המדויק של רצועות החלבון הסטנדרטיות, מכיוון שהן בקושי ייראו לאחר צביעת הג'ל.

הכתים את הג'ל על ידי הוספת 20 מיליליטר של SimplyBlue SafeStain לג'ל. דוגרים את הג'ל למשך שעה בטמפרטורת החדר, תחת תסיסה עדינה.

הסר את SimplyBlue SafeStain, והימנע מהג'ל ב-100 מיליליטר מים נטולי יונים בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין.

לאחר שעה יש להחליף במים טריים נטולי יונים ולהמשיך לדגור על הג'ל למשך שעה לפחות.