Multianalyte Immunobead Assay: טכניקת Immunoassay מבוססת זרימה לזיהוי בו-זמני של תת-סוגים מרובים של נוגדנים בדגימת סרום אנושי

בדיקת חרוזים אימונו-אנליטיים משתמשת במספר מיקרוספירות מצופות אנטיגן כדי לזהות את נוגדני המטרה המתאימים להם בו זמנית.

כדי להתחיל בבדיקה זו, קח תערובת של מיקרו-חרוזים בצינור המכיל את המאגר המתאים. כל חרוז מצופה באנטיגן ספציפי על פני השטח שלו, מה שמאפשר הבחנה קלה של חרוזים זה מזה.

פיפטה את תערובת החרוזים החיסוניים המצופים לבארות של צלחת בדיקת מיקרוטיטר. השלם את הבארות עם דגימת הסרום המכילה איזוטיפים שונים של נוגדני מטרה. לגרסאות אלה יש הבדלים עדינים במבנה שלהן, מה שמאפשר לכל באר להכיל מספר נוגדנים ראשוניים.

דגירה, כדי לאפשר לאיזוטיפים של נוגדנים לדוגמה להיצמד לאנטיגנים ספציפיים שנלכדו על חרוזי אימונוס בהתאמה. יש לשטוף עם מאגר בדיקה כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים. הוסף לבאר נוגדנים משניים מתויגים בצבע פלואורסצנטי, המתאימים לכל גרסה של נוגדן ראשוני.

כל נוגדן משני המסומן נקשר לאתר ה-Fc של הנוגדן הראשוני המתאים. קומפלקסים מרובים של נוגדנים ראשוניים של אנטיגן שנלכדו על ידי חרוזים מסומנים באופן פלואורסצנטי. שטפו את הצלחת כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.

קרא את הלוח באמצעות מנתח פלואורסצנטי המסוגל לזהות בו זמנית פלואורופורים שונים באורכי הגל שלהם. בהתאם לזיהוי האות, ניתן להעריך איזוטיפים שונים של נוגדנים בסרום וקשירתם לאנטיגנים שונים.

לביצועי בדיקה, השעו מחדש את המיקרוספירות המצומדות על ידי מערבולת למשך 30 שניות, וסוניקט למשך 60 עד 90 שניות. לאחר מכן, הסר את הכמות הנדרשת של כל קולואיד חרוזים מהצינור המתאים, ושלב את קולואידים החרוזים בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בגודל 1.5 מילימטר.

לאחר מכן, הכנס את הצינור למפריד מגנטי, ואפשר הפרדה למשך 60 שניות. כשהצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר את הסופרנטנט, מבלי להפריע לכדור החרוז.

לאחר הוצאת החרוזים מהמפריד, השעו מחדש את החרוזים ב -100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. מערבולת למשך 30 שניות לפני הכנסת הצינור למפריד מגנטי למשך 60 שניות, כדי להפריד את החרוזים. חזור על הכביסה פעמיים.

לאחר מכן, התאם את הריכוז של תערובת המיקרוספירה העובדת של שלוש פלקסים על ידי הוספת נפח מתאים של מאגר בדיקה כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מיקרוספירות לכל 1 מיקרוליטר, עבור כל מטרה.

הכניסו 25 מיקרוליטר מתערובת המיקרוספירה לכל באר של צלחת של 96 בארות. יש לדלל דגימות פלזמה או סרום פי 500 במאגר בדיקה, ולהכין דגימות סטנדרטיות בהתאם לטיטרציה הרצויה.

הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר בדיקה כדגימה הריקה, והוסף כל אחת מהדגימות המדוללות או התקן, לכל באר ייעודית של צלחת דגימה של 96 בארות. בסיום, מכסים את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף לדגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת המוגדר ל -700 סיבובים לדקה.

הכן תמיסה של נוגדנים לזיהוי אנטי-אנושי, או תמיסות נוגדנים משניות, ב-4 מיקרוגרם/מ"ל עם מאגר בדיקה, כמתואר בכתב היד. הנח את הצלחת על מפריד מגנטי לשטיפה מהירה, ולאחר מכן, הפוך בכוח את הצלחת על מיכל סיכון ביולוגי כדי להסיר נוזלים מהבארות. כשהצלחת עדיין הפוכה, הקש בכוח על הצלחת על חבילת נייר עבה.

לאחר מכן, שטפו כל באר עם 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה, והסירו את הנוזל על ידי היפוך חזק על מיכל ביולוגי. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את כל חבילות הנייר המשומשות למיכל ביולוגי

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת עבודה משנית של נוגדנים לכל באר של צלחת של 96 בארות, וכסה את הצלחת בנייר אלומיניום כדי לדגור על שייקר צלחת ב-700 סיבובים לדקה.

לאחר 30 דקות של דגירה, שטפו את בארות הצלחת פעמיים עם מאגר בדיקה, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל באר של צלחת 96 הבארות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, ודוגרים חמש דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר.

נתח דגימה של 60 מיקרוליטר באמצעות מנתח המכשיר בהתאם למדריך המערכת.