בדיקת כיראליות תא בצורת טבעת בצורת טבעת: טכניקת מבחנה לקביעת כיראליות רב-תאית בהתבסס על יישור תאים על מיקרו-תבניות בצורת טבעת

כדי לקבוע כיראליות של תאי יונקים במבחנה - ההטיה השמאלית-ימינה של התאים ליישור בכיוון שמאלה או ימינה בתנאים מגבילים - התחל עם שקופיות מצופות זהב בהתאמה אישית בצלחת מרובת בארות המכילה מדיה. השקופיות מורכבות ממיקרו-תבניות של איים בצורת טבעת של פיברונקטין מקדם הידבקות תאים, ממולאים בשכבה חד-שכבתית עמידה להדבקה עצמית.

לאחר מכן, זרעו נפח מתאים של תרחיף תאי יונקים על המגלשות ודגרו. התאים נספגים על המיקרו-דפוסים הטבעתיים המכילים פיברונקטין. השכבה החד-שכבתית בהרכבה עצמית שמסביב מונעת חיבור תאים לא ספציפי מחוץ לגבולות הטבעת.

החלף את המדיה, הסר את כל התאים הלא מחוברים, במדיה חדשה. הוסף תרופה מפריעה לאקטין לסט אחד של שקופיות ודגירה.

התאים הדבוקים מתרבים, מתפשטים ולובשים את צורת איי הפיברונקטין הבסיסיים, תוך ארגון מחדש של סיבי האקטין שלהם בתגובה לרמזים המרחביים, המגבילים את התא חד-שכבתי, ומקדמים יישור מוטה.

כעת, טפל בשקופיות עם פרפורמלדהיד לקיבוע תאים. תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, התאים במיקרו-דפוסי הטבעת מופיעים כאזורים כהים עם קווי מתאר בהירים מיושרים בהתאם להטיה המועדפת שלהם.

באמצעות תוכנה, חשב את זווית היישור של כל תא כסטייה מהכיוון ההיקפי של הטבעת. ממוצע לקביעת כיראליות תאי היונקים. תאים שטופלו בתרופות המפריעים לאקטין עשויים להפגין כיראליות הפוכה.

לפני זריעת התאים יש לחמם את המדיה והטריפסין באמבט מים, ממוזג ב -37 מעלות צלזיוס.

לחיבור תאים טוב יותר, יש להשרות את השקופית המעוצבת בצלחת של 12 בארות המכילה מצע תרבית, ולחמם אותה בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים עוברים טריפסין, נטרלו את התאים במדיה המכילה FBS. גלולה למטה את התאים ב-100 x גרם למשך 3 דקות, ולאחר מכן, השהה מחדש את גלולת התא במדיה טרייה. ספרו את התאים, ודללו את תרחיף התאים כדי להגיע לריכוז של 200,000 תאים למיליליטר.

הוסף 0.5 מיליליטר מתרחף התא לכל באר המכילה שקופית זהב אחת. נענע בעדינות את הצלחת מספר פעמים לזריעת תאים אחידה, לפני הדגירה למשך 15 דקות לחיבור התא. לאחר 15 דקות, בדוק את חיבור התא במיקרוסקופ, ובמידת הצורך דגור עוד זמן מה.

לאחר חיבור התאים, שאפו החוצה את המדיה המכילה תאים לא מחוברים מכל באר, והוסיפו 1 מיליליטר של מצע תרבית טרי. תרבית את התאים בחממה למשך 24 שעות ובדוק מפגש כדי לקבוע אם נוצרה כיראליות.

כאשר מושגת המפגש הנדרש, תקן את התאים על ידי הסרת אמצעי התרבית. לאחר שטיפה עם PBS פעם אחת, הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד 4% לשקופית, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, לפני שטיפה נוספת עם PBS שלוש פעמים.

כדי לרכוש את התמונות, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם פונקציונליות מצלמה, וצלם כל טבעת בשקופית ברזולוציה גבוהה.

לאפיון כיראליות, הורד את קבצי הקוד של MATLAB. הוסף את תיקיית הקוד ותיקיות המשנה לנתיב MATLAB ופתח את הקובץ "ROI_selection.m". בשורה 4, שנה את הספרייה לתיקיית הנתונים הרצויה.

שנה את גודל התמונה בשורה 14, כאשר שתי הדמויות הראשונות מייצגות את גודל העיגול הפנימי של הטבעת, בעוד שהשתיים האחרות מייצגות את החיצוני.

כדי לקבוע את אזור העניין או החזר ה-ROI בתמונות ניגודיות הפאזה, בצע את קוד MATLAB "ROI_selection.m" m על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. גרור ידנית את ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת, ולאחר מכן, לחץ פעמיים על התמונה כדי לאשר את הבחירה.

לאחר בחירת החזר ROI מכל התמונות בתיקיה, ייווצר קובץ ".mat" לאחסון מידע ההחזר על ההשקעה עבור כל תמונה. לאחר מכן, פתח את הקובץ "Analysis_batch.m" ושנה את הספרייה של התיקיה כפי שהודגם קודם לכן. לחץ על כפתור ההפעלה כדי לבצע את הקוד "Analysis_batch.m" כדי לקבוע את הכיראליות של דפוסי טבעת סלולריים מרובים.

ייווצר קובץ "datatoexcel.txt", המכיל סטטיסטיקה מעגלית עבור כל טבעת, כמו גם את מספרי הטבעות עם כיוון השעון, הלא-כיראלי ונגד כיוון השעון.