בדיקת ספיגת שלפוחית חוץ-תאית: שיטה לדמיין ולכמת ספיגה תאית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות טכניקת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית

כדי להקל על התקשורת התאית, תאים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות, EVs - מבנים בגודל ננו הסגורים בקרום שומנים. EVs נושאים מטענים ביולוגיים שונים, כולל מקרומולקולות ומטבוליטים, להעברתם לתאים המקבלים.

כדי לדמיין את קליטת EV על ידי תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ראשית, קח EVs מבודדים טריים. רכבים חשמליים אלה מסומנים מראש עם נוגדנים הקשורים לבדיקה פלואורסצנטית להדמיה קלה לאחר מכן.

הוסף נפח מספיק של EVs עם תווית פלואורסצנטית לתרבית תאים נמענת דביקה. דגירה לתקופה הרצויה. במהלך הדגירה, תת-אוכלוסייה של הרכבים החשמליים המסומנים נצמדת באופן שטחי למשטח התא, בעוד שרכבים חשמליים אחרים מופנמים.

הוסף צבע פלואורסצנטי אחר כדי לתייג את הציטופלזמה של התא, ועוזר להבחין בין EVs מופנמים לאלה המודבקים לתא המקבל. מקם את התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי ותמונה במישורי מוקד שונים לאורך ציר ה-z, ורכש סדרה של חתכים אופטיים על פני עובי הדגימה.

הרכיב אוסף זה של קטעים אופטיים - מחסנית z - ליצירת תמונת מדגם תלת מימדית ברזולוציה גבוהה. החל רינדור וירטואלי - תהליך שלאחר הדמיה - כדי לשחזר את משטחי התא.

כדי להבדיל בין רכבים חשמליים שהודבקו באופן שטחי לבין רכבים חשמליים מופנמים, עבדו אותם כנקודות בגוונים שונים. חשב את נפח התא ומספר הרכבים החשמליים שהופנמו על ידם, תוך כימות קליטת EV לכל תא.

זרע 4 x 10⁴ תאי PC3 לצלחת של 35 מיליליטר עם מדיה של 1 מיליליטר. אפשר לתאים להיצמד למשך הלילה בתנאי תרבית תאים אופטימליים. למחרת, שטפו את התאים הדבוקים פעמיים במדיה מדולדלת אקסוזום.

לאחר דילול ה-EVs המסומנים פלואורסצנטי לריכוז המתאים באמצעות מדיה מדוללת אקסוזום, הוסף את ה-EVs המדוללים לתאי המטרה המודבקים, ודגירה לזמן הניסוי הרצוי. לאחר הסרת EVs לא מופנמים על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים במדיה נטולת אקסוזומים, סמן את הציטופלזמה של התאים המודבקים ב-1 מיקרוגרם/מ"ל של CMTMR, ודגירה בתנאי תרבית תאים אופטימליים.

להדמיית תאים חיים, הנח את התאים המוכנים בחממה על הבמה. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה על סמך דגימות בקרה, קבע את עומק תאי המטרה, ואת טווח גודל הערימה בכיוון z כדי לרכוש תמונות קונפוקליות תלת מימדיות. לאחר מכן, הגדר את רכישת התמונה למספר תמונות בערימת z של צבע ספציפי לתא וצבע ספציפי ל-EV בו-זמנית.

לעיבוד תמונה, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה אוטומטית.

כדי לבנות משטחים וירטואליים של התאים, לחץ על 'הוסף משטחים חדשים'. כדי להגדיר את משטחי התא הווירטואליים, לחץ על כפתור '+ הוסף' ובחר 'איכות' כ"סוג מסנן". סף את הערך המתאים לגבול הנמוך על ידי בדיקה חזותית, הגדר את הערך המקסימלי עבור הגבול העליון ולחץ על כפתור 'סיום'.

לאחר מכן, כדי לבנות את הנקודות הווירטואליות של הרכבים החשמליים, לחץ על הכפתור 'הוסף נקודות חדשות'. תחת 'הגדרות אלגוריתם', בחר 'גדלי נקודה שונים' ו'חישוב המרחק הקצר ביותר'. לאחר מכן, לחץ על 'הבא' ובחר "ערוץ 1 - Alexa Fluor 488" כ"ערוץ המקור". הזן את הערך המתאים עבור 'קוטר XY משוער' תחת 'זיהוי נקודתי' ולחץ על 'הבא'.

כדי להגדיר את נקודות ה-EV הווירטואליות, לחץ על כפתור '+ הוסף' ובחר 'איכות' בתור 'סוג מסנן'. הגדר את "הסף התחתון" על ידי בדיקה ויזואלית ולחץ על 'הבא'. עבור "סוג אזורי נקודה", בחר 'עוצמה מוחלטת' ולאחר מכן לחץ על 'הבא'.

כדי לסף את האזור של נקודות EV, הזן את הערך המתאים עבור "סף אזור" על ידי בדיקה חזותית. בחר "קוטר מ" תחת "נפח אזור" ולחץ על "סיום".

כדי לפצל את הנקודות המקובצות בתוך המשטח הבנוי, לחץ על ה'נקודות' המובנות והיכנס ל'מסננים'. לאחר מכן, לחץ על כפתור 'הוסף' ובחר 'המרחק הקצר ביותר למשטחי משטחים = משטח 1' כ"סוג מסנן".

לאחר הגדרת הסף הנמוך ביותר עבור הגבול הנמוך והערך המתאים עבור הגבול העליון, לחץ על כפתור 'שכפל קטע לספוטים חדשים'.

לספירה אוטומטית של רכבים חשמליים בתוך התאים, לחץ על 'בחירת נקודות 1' הבנויה, עבור אל 'סטטיסטיקה' וייצא את הערך מ'המספר הכולל של נקודות'.

כדי להשיג את מספר התאים, לחץ על 'משטחים 1' המובנה, ולאחר מכן, עבור אל 'סטטיסטיקה' וייצא את הערך של "המספר הכולל של משטחים" מ'בסך הכל'. לבסוף, עבור לכרטיסייה 'מפורט' תחת 'סטטיסטיקה' כדי לייצא את אמצעי האחסון.