אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:44 דק׳ • July 8th, 2025
בתוך המיטוכונדריה, ציטראט סינתאז, הממוקם במטריקס של הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, הוא האנזים המגביל את הקצב המזרז את התגובה בין אצטיל קואנזים A לחומצה אוקסלואצטית ליצירת ציטראט, השלב הראשון במחזור חומצת הלימון.
כדי לנתח את פעילות הציטראט סינתאז, העבירו את בית החזה של זבוב דרוזופילה בוגרים הנמצאים בשפע במיטוכונדריה לתוך צינור מלא במאגר מיצוי צונן המכיל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, EDTA וחומר ניקוי לא יוני.
הומוגניזציה של רקמות בית החזה על קרח כדי למנוע דנטורציה של חלבון בתיווך חום. כוח הגזירה המופעל, בשילוב עם חומרי הניקוי, משחרר את הרקמה ומשחרר רכיבים תוך תאיים, כולל מיטוכונדריה.
יתר על כן, קרע בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי מוביל לשחרור חלבוני מטריצה מיטוכונדריאליים, כולל ציטראט סינתאז. EDTA נקשר לקטיונים דו-ערכיים ומעכב את פעילות הפרוטאז, ובכך מונע פירוק חלבון.
מדללים את ההומוגנאט באמצעות מאגר מיצוי ומוסיפים נפח מתאים לתערובת התגובה המכילה בארות של הצלחת מרובת הבארות. תערובת התגובה כוללת אצטיל קואנזים A, חומצה אוקסלואצטית וחומצה דיתיוניטרובנזואית.
ציטראט סינתאז בהומוגנאט מזרז את התגובה בין חומצה אוקסלואצטית לאצטיל קואנזים A, ויוצר ציטראט וקואנזים A עם קבוצת תיול. קבוצת התיול מגיבה עם החומצה הדיתיוניטרובנזואית חסרת הצבע, ויוצרת מוצר צהוב, חומצה תיוניטרובנזואית.
בעזרת קורא מיקרופלייט, מדוד את ספיגת התמיסה בצבע צהוב. הספיגה יכולה להיות קשורה לפעילות ציטראט סינתאז ברקמה ההומוגנטית.
העבירו מיד 10 חזה זבוב בוגר ל-100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי קר כקרח, והפכו אותם להומוגניזציה עם עלי על קרח. שמור את הדגימות קרות על ידי הומוגניזציה של חמש עד 10 שניות על קרח, תן להן לשבת על קרח במשך חמש שניות, ולאחר מכן, חזור על הפעולה עד שכל הרקמות הומוגניות לחלוטין.
יש להוציא 10 מיקרוליטר מכל דגימה הומוגנית לתוך שפופרת חדשה למדידת תכולת חלבון, תוך שמירה על צינורות אלה גם על קרח. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר מיצוי קר כקרח לכל דגימה שנותרה לנפח כולל של 500 מיקרוליטר, ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב.
עבור כל תגובה, הוסף 1 מיקרוליטר של ליזאט תאים מדולל ל -150 מיקרוליטר מתמיסת התגובה הטרייה שהוכנה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות. לאחר מכן, השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הספיגה ב-412 ננומטר כל 10 עד 30 שניות למשך ארבע דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
התווה את הנתונים כספיגה לאורך זמן, ולאחר מכן, חשב את השיפוע עבור החלק הליניארי של העקומה. לבסוף, חלקו את קצב התגובה או השיפוע בריכוז חלבון הדגימה כדי לנרמל את פעילות הציטראט סינתאז.