בדיקת פעילות ציטראט סינתאז: בדיקה קולורימטרית למדידת פעילות סינתאז ציטראט מיטוכונדריאלי בהומוגנט רקמות דרוזופילה

בתוך המיטוכונדריה, ציטראט סינתאז, הממוקם במטריקס של הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, הוא האנזים המגביל את הקצב המזרז את התגובה בין אצטיל קואנזים A לחומצה אוקסלואצטית ליצירת ציטראט, השלב הראשון במחזור חומצת הלימון.

כדי לנתח את פעילות הציטראט סינתאז, העבירו את בית החזה של זבוב דרוזופילה בוגרים הנמצאים בשפע במיטוכונדריה לתוך צינור מלא במאגר מיצוי צונן המכיל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, EDTA וחומר ניקוי לא יוני.

הומוגניזציה של רקמות בית החזה על קרח כדי למנוע דנטורציה של חלבון בתיווך חום. כוח הגזירה המופעל, בשילוב עם חומרי הניקוי, משחרר את הרקמה ומשחרר רכיבים תוך תאיים, כולל מיטוכונדריה.

יתר על כן, קרע בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי מוביל לשחרור חלבוני מטריצה מיטוכונדריאליים, כולל ציטראט סינתאז. EDTA נקשר לקטיונים דו-ערכיים ומעכב את פעילות הפרוטאז, ובכך מונע פירוק חלבון.

מדללים את ההומוגנאט באמצעות מאגר מיצוי ומוסיפים נפח מתאים לתערובת התגובה המכילה בארות של הצלחת מרובת הבארות. תערובת התגובה כוללת אצטיל קואנזים A, חומצה אוקסלואצטית וחומצה דיתיוניטרובנזואית.

ציטראט סינתאז בהומוגנאט מזרז את התגובה בין חומצה אוקסלואצטית לאצטיל קואנזים A, ויוצר ציטראט וקואנזים A עם קבוצת תיול. קבוצת התיול מגיבה עם החומצה הדיתיוניטרובנזואית חסרת הצבע, ויוצרת מוצר צהוב, חומצה תיוניטרובנזואית.

בעזרת קורא מיקרופלייט