JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 3:03 דק' • July 8th, 2025
ברקמות, ברזל, מינרל חיוני החיוני לתהליכים מטבוליים שונים, קיים בדרך כלל מבודד להמופרוטאינים וחלבוני ברזל שאינם הם. המופרוטאינים כוללים ברזל ברזל או הם הקשור לטבעות פורפירין, בעוד שחלבוני ברזל שאינם הם חסרים את מבנה טבעת הפורפירין וכוללים בעיקר ברזל ברזל או לא הם.
כדי להעריך את תכולת הברזל שאינו הם ברקמת הכבד של העכבר, טפל בשבר רקמת כבד של עכבר מיובש ונקצר עם ריכוזים נמוכים של חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית. דגירה בטמפרטורות גבוהות כדי לעכל את הרקמה ולהקל על משקעי חלבון המושרים על ידי חומצה.
בשל ריכוזי חומצה נמוכים, ברזל שאינו הם משתחרר מהחלבונים הנלווים. ברזל הם, בהיותו קשור לטבעת הפורפירין, נותר ללא פגיעה.
לאחר הקירור, העבירו את הנפח הרצוי של סופרנטנט המכיל ברזל שאינו הם לצלחת מרובת בארות. יש להוסיף את כלטור הברזל הכרומוגני, בתופננתרולין סולפונט, BPS, בתוספת חומצה תיוגליקולית, חומר מחזר, בבופר מתאים ולדגור.
חומצה תיוגליקולית מפחיתה את כל הברזל שאינו הם לברזל ברזל, שיכול להיקשר בקלות ל-BPS ביחס של 1:3, וליצור קומפלקס יציב ביותר בצבע ורוד. בנוסף, חומצה תיוגליקולית מונעת הפרעות עקב כל קטיוני מתכת דו-ערכיים מזהמים כגון נחושת שעלולים לקיים אינטראקציה עם BPS.
הנח את הצלחת מרובת הבארות בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה של קומפלקסי הברזל-BPS הוורודים, המייצגים את ריכוז הברזל שאינו הם בשבר רקמת הכבד של העכבר.
העבירו כל פיסת רקמה מיובשת לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. מוסיפים 1 מיליליטר מתערובת החומצה לשפופרת, וסוגרים אותה. הכן ריק חומצה באותו אופן, אלא שהרקמה מושמטת כאן.
דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות כדי לעכל את הרקמה.
לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, השתמש במיקרופיפטה המצוידת בקצות פלסטיק כדי להעביר 500 מיקרוליטר מתמצית החומצה השקופה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר.
הכן תגובות כרומוגניות ישירות לתוך המיקרו-לוחות הפוליסטירן השטוחים, 96 בארות, שקופים, לא מטופלים. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
מדוד את ספיגת הדגימה בקורא צלחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד ייחוס מים נטול יונים.