JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:25 דק' • July 8th, 2025
בתאים פעילים מטבולית, מצעים המכילים פחמן מתחמצנים באמצעות סדרה של תגובות ביוכימיות כדי לייצר אנרגיה ולשחרר פחמן דו חמצני כתוצר לוואי.
כדי לקבוע את קצב חמצון המצע, התחל בתרבית דבקה של התאים הלא מובחנים הרצויים. השלם את התאים בתווך עם מצע מתאים המכיל פחמן רדיואקטיבי ארבע עשרה בעמוד השדרה שלו, ודגירה.
התאים צורכים את המצע ומחמצנים אותו כדי לשחרר פחמן דו חמצני עם תווית רדיו, שמתפזר מהתאים לתווך שמסביב.
העבירו את המדיום הזה למכלול לכידת גז המכיל חומצה פרכלורית כדי להרוות את התגובה. צינור זה מכיל נייר סינון ספוג נתרן הידרוקסיד המותקן בתוך מכסה הצינור. סוגרים את הכובע ודוגרים.
במהלך הדגירה, הפחמן הדו חמצני, בצורתו הגזית, משתחרר בתוך הצינור. נתרן הידרוקסיד סופג את הפחמן הדו חמצני המסומן ברדיו, ולוכד אותו בנייר המסנן. העבירו את נייר הסינון הזה לבקבוקון המכיל קוקטייל נצנוץ, ומקמו אותו בתוך דלפק הנצנוץ הנוזלי.
בתוך הדלפק, פחמן עם תווית רדיו עובר דעיכה רדיואקטיבית, ופולט חלקיקי בטא בעלי אנרגיה גבוהה. חלקיקים אלה נספגים על ידי מרכיבי קוקטייל הנצנוץ ופולטים פולסי אור, המחושבים על ידי מונה הנצנוץ.
כמות הרדיואקטיביות שזוהתה נמצאת בקורלציה עם קצב חמצון המצע בתאים.
שטפו את התאים בבארות הנוספות, פעמיים עם DPBS. נתק את התאים עם 0.25% טריפסין-EDTA. השעו מחדש 20 מיקרוליטר של תאים מעוכלים ב-DPBS עם 20 מיקרוליטר של תמיסת צבע תפוז אקרידין ופרופידיום יודיד. קבע את מספר התאים החיים עם מונה תאים אוטומטי ורשום את המספר.
שטפו את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם DPBS. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום חם לכל באר בדיקה במכסה המנוע המיועד ל-RAM. לאחר איטום הצלחת בפרפילם, יש לדגור את התאים באינקובטור ייעודי ל-RAM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.
במהלך הדגירה, חותכים נייר סינון לחתיכות עגולות מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ומכניסים את הנייר היטב לתוך המכסה. הוסף 200 מיקרוליטר של 1 חומצה פרכלורית מולרית לכל צינור, ו-20 מיקרוליטר נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך המכסה.
לאחר הדגירה של התאים, העבירו 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים, וסגרו מיד את המכסים. השאירו את הצינורות במתלה צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה.
במקביל, במהלך הדגירה, הגדר בקבוקון נצנוץ לכל צינור, ומלא אותו ב -4 מיליליטר נוזל נצנוץ. מעבירים כל פיסת נייר סינון לבקבוקון נצנוץ, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
בצע בדיקות ניגוב על מכסה המנוע של תרבית הרקמות, אמבט המים, המקרר, החממה, הכיור, הקרקע וכל אזור עבודה אחר לאיתור זיהום RAM פוטנציאלי. הכניסו את מגבוני הנייר לבקבוקוני נצנוץ המכילים נוזל נצנוץ.
מדוד רדיואקטיביות פחמן-14 בבקבוקוני הנצנוץ בעזרת מונה נצנוץ, ורשום את תוצאות הקריאה. לטהר את סביבת העבודה בהתאם להנחיות בטיחות הקרינה, במידת הצורך.