בדיקה דו-שכבתית ליפידית נתמכת כדורית: טכניקה לצפייה במכלול ספטין על מיקרוספרות

ספטינים הם חלבוני שלד מרכזיים הנקשרים למשטחי קרום פלזמה מעוקלים.

כדי לצפות בהרכבת ספטין במבחנה על מיקרוספרות, ראשית, קח השעיה של חרוזי סיליקה מיקרוסקופיים בגודל אחיד, הפועלים כתמיכה מוצקה להיווצרות דו-שכבתית. מערבולת את המתלה הזה כדי לשבור כל אשכולות חרוזים.

השלימו אותו עם שלפוחיות חד-כיווניות קטנות, רכבי שטח - שלפוחיות כדוריות המוקפות בשכבת שומן דו-שכבתית אחת. דגירה עם תסיסה מתמדת, ומונעת שקיעה של מיקרוספירות.

במהלך הדגירה, קבוצות הראש הקוטביות החיצוניות מקלות על ספיחה של רכבי שטח על פני המיקרוספרה ההידרופילית. אינטראקציה זו גורמת לרכבי שטח להיקרע, ואחריו היתוך של שומנים של SUV על פני המיקרוספרה המעוקלת כשכבה רציפה, וכתוצאה מכך נוצרת שכבת שומנים כדורית ונתמכת, SLB.

יש לשטוף כדי להסיר עודפי שומנים לא קשורים ולהשהות מחדש במאגר תגובה. העבירו את תרחיף ה-SLB הכדורי לאזור קטן של משטח מצופה פוליאתילן גליקול, כדי למנוע ספיחות לא ספציפיות. הוסף לתא תרחיף ספטין עם תווית פלואורסצנטית ודגירה.

ספטינים יוצרים הטרו-אוליגומרים המזהים את העקמומיות החיובית של SLBs כדוריים, ומתפלמרים ליצירת חוטים. בסופו של דבר, חוטי מחיצה מתקשרים זה עם זה, מה שמוביל להיווצרות מבנים מסדר גבוה יותר.

התבונן ב-SLBs מצופים ספטין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה. נוכחות הקרינה מעידה על שקיעה רגישה לעקמומיות של ספטין.

ראשית, מערבל את הבקבוק המכיל מיקרוספירות סיליקה למשך 15 שניות. לאחר מכן, אמבטיה-סוניקט למשך דקה אחת, ומערבולת שוב למשך 15 שניות כדי לשבור כל אשכולות. מערבבים את החרוזים עם SLBB ו-10 מיקרוליטר של רכבי שטח של 5 מילי-מולאר בצינור מיקרו-צנטריפוגה בעל הידבקות נמוכה.

דגרו על תערובת החרוזים-שומנים למשך שעה בטמפרטורת החדר, על שייקר למניעת שקיעה. בינתיים, הפשירו כיסוי PEGylated, והדביקו אליו צינור PCR חתוך של 0.2 מיליליטר. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את החרוזים למשך 30 שניות ב-RCF המיועד.

לאחר הסיבוב הראשון, הסר 50 מיקרוליטר של סופרנטנט. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטר PRB ומערבבים על ידי פיפטינג נמרץ. לסבבים הבאים, הסר 200 מיקרוליטר PRB, והוסף עוד 200 מיקרוליטר לאחר הסיבוב השני והשלישי, והוסף 220 מיקרוליטר PRB לאחר הסיבוב הרביעי.

אם מבצעים בדיקת תחרות עם מספר גדלי חרוזים, הכינו את התגובה על ידי ערבוב נפחים שווים של כל גודל חרוז, ודילול 29 מיקרוליטר מתערובת חרוזים זו עם 721 מיקרוליטר של מאגר תגובה. לאחר מכן, הוסיפו לבארות 75 מיקרוליטר של חרוזים מדוללים ו -25 מיקרוליטר של החלבון המדולל ב- SSB וערבבו.

אם מודדים מחיצות במצב יציב, דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן, צלמו על ידי מיקרוסקופיה כמעט TIRF או קונפוקלית.