אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:38 דק׳ • July 8th, 2025
חלבונים קושרי RNA גרעיניים, RBPs, הם חלבונים רב-תכליתיים המורכבים מאזורים מסודרים עם מבנה תלת מימדי מוגדר היטב ואזורים פחות יציבים ומופרעים מהותית, IDRs.
במספר מחלות נוירודגנרטיביות, מוטציות ספציפיות ל-IDR גורמות ל-RBPs להתמקם באופן שגוי בציטופלזמה, ולעסוק באופן חריג באינטראקציות חלשות, ויוצרות תכלילים דינמיים וחסרי ממברנה - תופעה הנקראת הפרדת פאזה. בסופו של דבר, תכלילים אלה מבשילים לאגרגטים רעילים ובלתי מסיסים, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של תאי העצב וניוון.
כדי לחקור הפרדת פאזה של RBP in vivo באמצעות אופטוגנטיקה, התחל עם זחל דג זברה טרנסגני מורדם ונטול כוריון, המבטא RBP שעבר מוטציה IDR המותך לדיווח פלואורסצנטי ותחום קולטן אור רגיש לאור כחול, במאגר מתאים.
לאחר מכן, הרכיבו את הזחל לרוחב על טיפת אגרוז מותכת להדמיית חוט השדרה. אפשר לאגרוז להתמצק, ומשתק את הזחל. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, רכשו תמונות חוט שדרה כדי לדמיין את ה-RBPs הפלואורסצנטיים, הממוקמים בתוך גרעיני העצבים.
כעת, הוציאו את הזחל מהאגרוז והעבירו לצלחת מרובת בארות המכילה חיץ. מקם את הצלחת על לוח דיודות פולט אור כחול אופטימלי והאיר את הזחל.
עם חשיפה לאור כחול, ה-RBPs המוטנטיים מתמקמים באופן שגוי לציטופלזמה, שם תחומי קולטני האור עוברים אוליגומריזציה ויוצרים אשכולות, מה שמביא את ה-IDRs של ה-RBPs בסמיכות ומקל על השיוך העצמי שלהם
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים