JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:08 דק' • July 8th, 2025
אנגיוגנזה היא היווצרות כלי דם חדשים מכלי הדם הקיימים במהלך מצבים התפתחותיים ופתולוגיים. תקשורת נרחבת בין תאי האנדותל המצפים את פני השטח הפנימיים של כלי הדם לבין הפריציטים הסובבים - תאים תומכים בצד החיצוני של כלי הדם - חיונית לאנגיוגנזה.
כדי לחקור אנגיוגנזה במבחנה, התחל עם תאי אנדותל וחרוזי מיקרו-נשא מצופים פריציטים התלויים בתמיסת פיברינוגן - גליקופרוטאין מסיס הפועל כמבשר פיברין.
כעת, פיפטה את תרחיף החרוזים לצלחת תרבית המכילה תמיסה של תרומבין - אנזים פרוטאוליטי, ודגירה. תרומבין נקשר למולקולת הפיברינוגן, וגורם למחשוף שלה ליצור מונומרים פיברינים בלתי מסיסים, ויוצר ג'ל פיברין פולימרי. שלב זה מבטיח הטמעה של חרוזים מצופים תאים בג'ל הפיברין.
לאחר מכן, יש להניח תרבית של פיברובלסטים - תאי מבשר רקמת חיבור - על גבי ג'ל הפיברין ולדגור כדי לאפשר את הפעלת הפיברובלסטים.
במהלך הדגירה, הפיברובלסטים מפרישים גורמי גדילה אנגיוגניים חיוניים המעוררים הפעלת תאי אנדותל. בשילוב, פריציטים נדבקים ותאי אנדותל מפרישים מולקולות איתות המסייעות בהנבטת תאי אנדותל בג'ל הפיברין.
נבטי האנדותל מופיעים כבליטות תאים מוארכות עטופות בפריציטים, המתארות את השלב המוקדם של אנגיוגנזה.
בחנו את הכלים של חרוזים מצופים מיקרו-נשא מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 כדי לוודא שכל החרוזים צופו מספיק על ידי תאי האנדותל.
העבירו את הלוחות למכסה זרימה למינרית, והשתמשו בפיפטה P1000 כדי לשאוב במרץ ולהוציא את תמיסות החרוזים המצופים כדי לנתק את התאים מתחתית הצלחות, ולהעביר את הסופרנטנטים לצינורות בודדים.
הניחו לחרוזים להתיישב בתחתית הצינורות למשך שלוש דקות. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה P1000 כדי להסיר כמה שיותר מהסופרנטנטים מבלי להפריע לאשכולות החרוזים. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של מדיום שלם לכל צינור, ואפשרו לחרוזים להתיישב למשך 30 עד 60 שניות. השתמש בפיפטה P1000 כדי לשאוב שוב את הסופרנטנט, ושטוף את תאי האנדותל הצפים בחופשיות מתרחיף החרוזים עם מדיום שלם טרי, פעמיים נוספות, כפי שהודגם זה עתה.
לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את החרוזים ב -2.5 מיליליטר תמיסת פיברינוגן. הוסף 13 מיקרוליטר תמיסת טרומבין לבאר, בצלחת תחתונה מזכוכית של 24 בארות. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר מתמיסת החרוזים/פיברינוגן לכל באר, הקפידו לזרוק בזהירות את החרוזים ישירות לתוך התרומבין, ולאט לאט למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש כדי לערבב היטב את התמיסות.
לאחר שכל הבארות נזרעו, אפשר לתמיסת התרומבין-פיברינוגן להיקרש מראש במכסה הזרימה הלמינרי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה מעבירים בזהירות את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 עד שעתיים נוספות.
כאשר הג'ל התמצק במלואו, השהה מחדש פיברובלסטים רגילים של ריאות אנושיות בריכוז של 2 x 104 תאים למיליליטר במדיום שלם, והוסף מיליליטר אחד של פיברובלסטים לכל באר. לאחר מכן, החזר את הצלחת לחממת תרבית התאים.