בדיקה מקומית: טכניקה להערכת הפוטנציאל קוטל החרקים של אנטגוניסטים לקולטני דופמין על יתושים בוגרים על ידי יישום מקומי

בדיקת בדיקה מקומית ביתושים תלויה בתצהיר ישיר של תרכובת בדיקה פעילה על בית החזה הגבי של יתושים בוגרים כדי לבדוק את תכונת קוטלי החרקים שלה.

כדי להתחיל, יש להרדים יתושים נקבות בוגרות על ידי חשיפתן למינימום התרמי הקריטי - טמפרטורה נמוכה המפסיקה את פעילותן העצבית-שרירית.

הנח יתושים נקבות מורדמות בודדות מתחת למיקרוסקופ מנתח. קח מזרק זכוכית המחובר למיקרו-אפליקטור מלא בתרכובת הבדיקה - אנטגוניסט לקולטן דופמין - בממס שאינו קוטבי. מקם את המחט ליד בית החזה והשתמש במיקרו-אפליקטור כדי להפקיד בזהירות טיפה של תרכובת הבדיקה על פני הגב.

לאחר היישום, העבירו את היתושים המטופלים לתא גידול עם תנאי סביבה מבוקרים לתקופה מוגדרת.

הממס הלא קוטבי בטיפה ממיס שומנים בציפורן - כיסוי חיצוני - ומאפשר לתרכובת לחדור פנימה. התרכובת מתפזרת דרך שכבת האפידרמיס שמתחתיה ומגיעה לגרעיני בית החזה - קבוצה צפופה של תאי עצב המחוברים למערכת העצבים.

עם הגעתה לתאי העצב, התרכובת נקשרת לאתר אלוסטרי - אתר קישור נוסף למולקולות רגולטוריות - על קולטן הדופמין. הקישור האלוסטרי מעכב את מפל האיתות במורד הזרם עם הקישור לדופמין - מוליך עצבי השולט בתהליכים ביולוגיים קריטיים - מה שמוביל למוות.

לאחר משך הניסוי, רשום את מספר היתושים המתים - אנשים שטופלו ללא כל תנועה - כדי להעריך את פוטנציאל קוטלי החרקים של תרכובת הבדיקה.

תרבות יתושים נקבות בוגרות בנות 3 עד 5 ימים בכלוב פלסטיק של 20 ליטר. סמן כוסות נייר של 9 אונקיות עם השם והריכוז של תרכובת הבדיקה.

לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר של תרכובת הבדיקה באצטון בבקבוקון זכוכית של 20 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי את תמיסת המלאי כדי להשיג את ריכוזי העבודה הרצויים.

נקו מזרק זכוכית של 1 מיליליטר עם אצטון, ולאחר מכן מלאו אותו בתמיסת הבדיקה בריכוז המתאים. אבטח את המזרק במיקרו-אפליקטור המותאם לספק נפח של 0.25 מיקרוליטר.

לאחר מכן, השתמש בשואב כדי להוציא מהכלוב עשר יתושים נקבות בוגרות בנות 3 עד 5 ימים, ולהרדים אותן למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את היתושים לצלחת פטרי, והניחו את המנה על קרח למשך 10 דקות.

על מנת להימנע מפגיעה ביתוש הבוגר, שעלול לתרום לתמותה, יש לוודא שהוא לא מורדם במקרר יותר מ-5 דקות, או משותק על קרח יותר מ-10 דקות, ולמזער את הטיפול ביתושים. אם יש לך גישה לצלחת קרה ולמיקרומניפולטור עם במה ניתנת להזזה, זה עשוי למזער עוד יותר את הטיפול ביתושים.

השתמש בפינצטה עדינה כדי להסיר כל יתוש מהצלחת. בעזרת המיקרו-אפליקטור של המזרק, יש למרוח 0.25 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה על בית החזה הגבי תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, העבירו את היתושים לכוס נייר מסומנת על קרח. אטמו את הכוס עם ריבוע רשת בגודל 10 על 10 ס"מ, וגומייה. לאחר מכן, העבירו אותו לתא הגידול, ורשמו את מספר היתושים המתים.