JoVE Encyclopedia of Experiments
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:38 דק' • July 8th, 2025
אנדוטוקסין, רעלן חיידקי גרם שלילי הקיים על הממברנה החיצונית, הוא ליפופוליסכריד, LPS, המורכב בעיקר משומנים ופוליסכרידים, כולל ליפיד A ואנטיגן O. כאשר הוא משתחרר במהלך זיהום, הוא מזוהה על ידי מערכת החיסון, ומעורר תגובות דלקתיות מבוססות ציטוקינים.
כדי להעריך זיהום אנדוטוקסין בננו-פורמולציה של תרופה ליפוזומלית באמצעות לימולוס אמבוציט ליזאט, LAL, מבחן, הכינו צינורות תגובה, האחד מכיל את התרופה והשני מכיל את התרופה עם ריכוז אנדוטוקסין ידוע.
הוסף מגיב LAL המכיל חלבון ליזאט המתקבל מסרטן פרסה, לימולוס פוליפמוס, תאי דם או אמבוציטים. הליזט כולל פרוטאזות סרין לא פעילות - פקטור B, פקטור C, אנזים קרישה - וחלבון קרישת ג'ל, קרישה.
מערבל את הצינורות והעמיס אותם לתוך עכירות כדי למדוד את עכירות התמיסות.
בנוכחות LPS מזהם הקשור לתרופות ליפוזומליות, פקטור C הרגיש ל-LPS מופעל באופן אוטוקטליטי, אשר לאחר מכן מתבקע ומפעיל את פקטור B הממיר את האנזים מעודד הקרישה לאנזים קרישה. אנזים פעיל זה מבקע את קשרי פפטיד הקרישה ויוצר מונומרים של קואגולין.
בסופו של דבר, המונומרים מתפלמרים באמצעות אינטראקציות בין האזורים ההידרופוביים החשופים על ראשו של אחד לזנב ההידרופובי של אחר, מה שמוביל לצבירה והיווצרות של ג'ל קואגולין עכור בלתי מסיס. העכירות הנמדדת עוזרת לקבוע את ריכוז האנדוטוקסין בפורמולציה הננו.
התאוששות ספייק מחושבת מריכוזי האנדוטוקסין בדגימות הספייק והבדיקה בטווח המקובל מצביעה על כך שאין הפרעה משמעותית מהננו-פורמולציה, ומאמתת את נוכחותם של אנדוטוקסינים בתרופה הננו-פורמולציה.
להכנה סטנדרטית של כיול, השתמש ב-900 מיקרוליטר של לימולוס אמבוציט ליזאט או מים בדרגת LAL, ו-100 מיקרוליטר של אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה, כדי להכין כמה שיותר דילולי ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת תקן כיול בריכוז של יחידת אנדוטוקסין-אחת למיליליטר.
לאחר מכן, באמצעות 900 מיקרוליטר של מים בדרגת LAL ו-100 מיקרוליטר של תקן כיול אנדוטוקסין-יחידה-למיליליטר, הכינו תקן כיול שני בריכוז של 0.1 אנדוטוקסין-יחידה-למיליליטר.
לאחר מכן, חזור על הדילול הסדרתי פי 10 כדי להכין שני תקני כיול נמוכים יותר, כדי להשיג בסך הכל ארבעה תקני כיול הנעים בין 0.001 ל-1 אנדוטוקסין-יחידה-למיליליטר.
להכנת בקרת איכות של 0.05 יחידת אנדוטוקסין למיליליטר, שלב 50 מיקרוליטר של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של תמיסת אנדוטוקסין סטנדרטית עם 950 מיקרוליטר מים בדרגת LAL.
לאחר מכן, בתוכנה, בחר את 'הגדרות מכשיר' וצור את התבנית. בחרו 'איסוף נתונים', והזינו את מזהה הבדיקה ואת קבוצת הנתונים בלשונית 'כללי'. תחת הכרטיסייה 'חומרה', בחר את סוג המכשיר ואת שיטת LAL, וודא שמספר סידורי, מזהה המערכת ופרטי היציאה הטורית מופיעים על המסך.
לחץ על 'אישור' פעמיים כדי לאשר את בחירת המכשיר ואת התקשורת עם המכשיר, והזן את מזהי הדגימה באותו סדר שבו ייבדקו הדגימות. לאחר מכן, השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את הבקרה השלילית, העקומה הסטנדרטית ודגימות הבדיקה.
הוסף את הנפח המתאים של תקני כיול בקרה שלילית ובקרת איכות לתוך צינורות זכוכית משוכפלים עם תווית מראש, והוסף את הנפח המתאים של LAL לבקבוקון הבדיקה הראשון. מערבל את הבקבוקון לזמן קצר, והנח את הבקבוקון בחריצי הבדיקה המתאימים בקרוסלת המכשירים.
לפני טעינת הדגימות, בצע מספר דילולים של ננו-חומר הבדיקה בתוך הדילול התקף המרבי כפי שהודגם.